中国人群CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4基因多态性与茶碱体内清除率的相关性研究

摘要

茶碱是临床常用的平喘药，应用已有80多年的历史，平喘作用快，能迅速改善呼吸道痉挛状况。而且茶碱类药物有很多常见的不良反应，如心率失常、心肌缺血、失眠、谵妄、癫痫等，严重可导致死亡。因而茶碱的临床应用必须在血药浓度监测下合理应用，才能保证给药的安全性和有效性，国内外都将其列为主要监测药物之一。
　　由于肝细胞色素P450酶1A2(CYP1A2)对茶碱具有高亲和力，低浓度茶碱在体内的代谢过程主要由CYP1A2介导。细胞色素P450酶2E1(CYP2E1)对茶碱具有低亲和力和高容量，因此在高浓度时主要由CYP2E1介导。细胞色素P450酶3A4(CYP3A4)也参与了茶碱体内的代谢，但是，由于CYP3A4对茶碱具有低亲和力和低容量，因此对茶碱代谢的影响较小。三个代谢酶的基因多态性是否对茶碱体内代谢有影响仍然没有定论。
　　我们的前期工作分析了426名健康中国人CYP1A2酶活性与其功能位点的关系，发掘了5个单倍型标签SNP，构建了15条纯合子及突变频率大于3％的杂合子的单倍体。考察了这5个位点SNP及15条单倍体对CYP1A2酶活性的影响，发现CYP1A2新的突变位点G-3113A影响CYP1A2酶活性，G→A的突变酶活性降低，CYP1A2*1B与CYP1A2*1C野生纯合子CYP1 A2酶活性略降低，而T3594G和CYP1A2*1F不同基因型间CYP1 A2的活性无显著差异。单倍型之间CYP1A2酶活性也存在较大的差异，携带-3113A/A位点单倍型对表现为低酶活性，携带-3113G/G位点单倍型对表现为高酶活性。在这个研究基础上，我们进一步研究了37个健康中国人4个功能性位点突变纯合子对茶碱体内代谢的影响，发现4个位点突变纯合子之间茶碱体内代谢无差异。
　　因此，我们的前期研究发现CYP1A2 G-3113A位点突变可能导致CYP1A2酶活性降低，由于受样本量的影响，未发现CYP1A2 G-3113A对茶碱体内代谢影响具有统计学意义，因此茶碱体内代谢的个体差异的机制仍然不是很清楚。本研究试图从CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4三个代谢酶功能位点的突变，分析对茶碱体内清除率的影响，以明确影响茶碱体内代谢个体差异的遗传机制。
　　方法:
　　筛选了2013年9月-2014年7月符合入组条件的门诊患者111例，脱落10例，最终入组101例，其中男性受试者63例，女性38例，其中吸烟者18例，不吸烟者83例。101例受试者采集空白血样后，口服茶碱100 mg，2/日。2周后复诊，空腹不服药后采集外周血样2 ml于EDTA抗凝管，-80℃低温冰箱冻存。试验前征得南方医科大学珠江医院伦理委员会同意，签署知情同意书。试验在美国临床试验网(ClinicalTrials.gov)注册，并获得了注册编号(NCT02001935)。茶碱及其代谢产物（1，3-二甲基尿酸）的测定采用高效液相色谱法(HPLC)的方法。茶碱清除率用1，3-二甲基尿酸/茶碱(1，3-DU/TP)比值来计算。应用酚-氯仿法提取外周血白细胞中的DNA，进行PCR产物扩增后基因测序仪直接测序。CYP1A2基因检测了5个位点，CYP1A2 G-3860A（CYP1A2*1C）、C-164A(CYP1A2*1F)、C5347T(CYP1A2*1B)、G-3113A是我们前期研究发现在中国人群中存在多态性的位点，G-3533A(CYP1A2*7)在白种人中报道有功能活性的位点，此次也纳入检测范围。CYP2E1检测了4个在亚裔人群中报道有功能活性的4个位点:G1132A（CYP2E1*2）、G10023A(CYP2E1*3)、G4768A(CYP2E1*4)、G-1293C/C-1053T(CYP2E1*5B)。CYP3A4检测了5个在亚裔人群中报道具有多态性的位点:A13871G（CYP3A4*4）、C15702G（CYP3A4*5）、17661del(CYP3A4*6)、T20070C(CYP3A4*18A)、C23237T(CYP3A4*19)。对检测出有多态性的位点进行了单倍体的构建，进一步统计分析单个核苷酸位点多态性(SNP)及单倍型对茶碱体内清除率的影响。
　　统计方法:
　　所有数据用mean±SD表示，按照不同基因型对受试者分组。单个SNP位点不同基因型间茶碱清除率的比较采用单因素方差分析的方法(One-way Analysisof Variation，one-way ANOVA)。不同性别间及两种基因型之间茶碱清除率的比较采用独立样本双侧t检验方法。P＜0.05被认为具有统计学上的显著意义。所有统计采用SPSS13.0软件。
　　结果:
　　1.101患者中有1例样本检测数据缺失，计算了100例样本茶碱的药物浓度及茶碱清除率。100例患者口服茶碱100 mg，2/日后平均稳态浓度为3.52±1.45mg/L（mean±SD），最高浓度:8.31 mg/L，最低:1.13 mg/L。平均茶碱清除率(1，3-DU/TP)0.058±0.033，最高清除率:0.259，最低清除率:0.041。茶碱体内清除率存在着较大的个体差异。
　　2.101例受试者CYP1A2 G-3860A(CYP1A2*1C)突变频率为30.7％、C-164A(CYP1A2*1F)突变频率为30.0％、C5347T（CYP1A2*1B）突变频率为15.8％、G-3113A突变频率为9.9％。这几个位点的突变频率与我们之前研究的结果非常一致，而与白种人群的突变频率相差较大。而G-3533A(CYP1A2*7)在白种人中报道存在多态性，我们这次研究没有发现该位点存在突变。进一步分析4个具有多态性的位点不同基因型茶碱清除率之间的差异发现，CYP1A2 G-3860A、C-164A、C5347T不同基因型之间茶碱清除率没有差异(P＞0.05)。G-3113A突变纯合子AA型只有2例，合并到突变杂合子GA组，与野生型GG组比较，茶碱清除率有差异(P=0.016)，-3113位点G→A茶碱清除率降低。
　　3.CYP2E1 G1132A（CYP2E1*2）突变频率为0.5％，与文献报道的亚裔人群突变频率1.2％稍有差异。G10023A(CYP2E1*3)、G4768A(CYP2E1*4)本次研究未筛查到具有突变。G-1293C/C1053T(CYP2E1*5B)突变频率为18.8％，与文献报道的亚裔人群中的突变频率19-27％接近，但是与白种人中报道的突变频率0.8-1.0％，相差较大。进一步分析CYP2E1*5B不同基因型之间茶碱清除率之间的差异发现，CYP2E1*5B不同基因型之间茶碱清除率没有差异（P=0.731）。
　　4.CYP3A4检测了5个位点突变频率较低。筛查到A13871G（CYP3A4*4）突变杂合子仅1例，突变频率0.5％，T20070C（CYP3A4*18A）突变杂合子4例，突变频率为2％。其他3个位点C15702G（CYP3A4*5）、17661 del(CYP3A4*6)、C23237T(CYP3A4*19)没有筛查到突变。进一步分析T20070C（CYP3A4*18A）野生型纯合子与杂合子之间茶碱清除率的差异，没有发现CYP3A4*18A位点突变对茶碱清除率有影响。
　　5.对具有多态性的CYP1A2的4个位点的SNP进行单倍型构建，共构建了15条单倍型基因型。对单倍型对进行进一步的茶碱清除率分析发现，单倍型对-3113G/G-164A/A-3860G/G-5347T/C与其他单倍型比较茶碱清除率增加，而其他单倍型茶碱清除率无差异。
　　结论:
　　1.本研究发现，茶碱100 mg，2/日的给药剂量，2周后体内平均稳态药物浓度为3.52 mg/L，达不到茶碱常用的平喘浓度(10-20mg/L)，＜10 mg/L的茶碱浓度能起到一个免疫调节和增强激素敏感性的作用，建议小剂量茶碱与激素合用，以达到茶碱增强激素敏感性的作用。
　　2.本次研究考察了CYP1A2、CYP2E1与CYP3A4的14个位点，CYP1A2的4个位点与CYP2E1的1个位点突变频率较高，即CYP1A2 G-3860A(CYP1A2*1C)、C-164A(CYP1A2*1F)、C5347T(CYP1A2*1B)、CYP1A2G-3113A、G-1293 C/C1053T(CYP2E1*5B)突变频率较高，与文献报道的亚裔人群的突变频率接近，但是与白种人群的突变频率相差较大。而其他的几个位点突变频率较低或者是没有突变，与文献报道的突变频率稍有差异。因此本次研究也证实了CYP1A2、CYP2E1与CYP3A基因多态性存在着种族差异。
　　3.分析突变频率较高的几个SNP不同基因型茶碱清除率的差异后仅发现CYP1A2 G-3113A位点茶碱体内清除率降低，未发现其他位点突变对茶碱体内清除率有影响。这是本次研究首次发现CYP1A2 G-3113A影响茶碱体内代谢，因为CYP1A2 G-3113A位点突变频率中国人群比白种人群高，或许可以在一定程度上解释中国人群茶碱体内代谢比白种人群要慢的原因。
　　4.通过对不同的单倍型对基因型茶碱体内清除率的比较发现，-3113G/G-164A/A-3860 G/G-5347T/C单倍型对基因型茶碱体内清除率增加。因此考察基因多态性对茶碱体内代谢的影响，还需考虑单倍型对的影响。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 药物基因组学

1．2 茶碱

1．3 CYP1A2、CYP2E1及CYP3A4基因多态性

1．4 前期的研究工作

参考文献

第二章 CYP1A2基因多态性与茶碱体内清除率的相关性研究

前言

2．1 材料与方法

2．2 研究结果

2．3 讨论

2．4 小结

附件 2-1

附件 2-2

参考文献

第三章 CYP2E1基因多态性与茶碱体内清除率的相关性研究

前言

3．1 材料与方法

3．2 研究结果

3．3 讨论

3．4 小结

参考文献

第四章 CYP3A4基因多态性与茶碱体内清除率的相关性研究

前言

4．1 材料与方法

4．2 研究结果

4．3 讨论

4．4 小结

参考文献

全文总结

附录

缩写词一览表

攻读学位期间的成果

致谢

声明

统计学审稿证明