金黄色葡萄球菌非蛋白成分PGN模拟肽保护性作用机制研究及LTA模拟肽初步筛选和鉴定

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分 金黄色葡萄球菌非蛋白成分PGN模拟肽保护性作用机制研究
　　一、PGN模拟肽合成与体外鉴定
　　1.线性肽SP27特异性结合抗PGN单抗根据前期工作，选择含保守序列“xH”的No.27号阳性噬菌体克隆(SPHxHSRLRSES)合成线性肽SP27(Biotin-(SA)SPHxHSRLRSES(GG))和SP27b(Biotin-SPHxHSRLRSES(SAGG)),SA、GG、SAGG为两侧发挥支架作用的氨基酸残基，ELISA结果显示:SP27和SP27b均呈剂量依赖性特异性结合抗PGN单抗，且不与抗LTA单抗反应，提示核心序列SPHxHSRLRSES模拟PGN表位。
　　2.四分枝多价抗原肽MAP27特异结合抗PGN单抗及抗S.aureus多抗基于SP27序列，以多聚赖氨酸为支架合成四分枝多价抗原肽MAP27，ELISA结果显示:MAP27不仅能够特异性结合抗PGN单抗(MAP27 vs MAP(ctrl)，P=0.02; MAP27 vs PBS，P=0.021)也能特异性结合抗金葡菌多克隆抗体(MAP27vs MAP(ctrl)，P=0.002; MAP27 vs PBS，P=0.002)，提示MAP27维持原始线性肽SP27抗原性，模拟PGN抗原表位。
　　3.MAP27模拟PGN表位刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌促炎性细胞因子100μg/ml MAP27体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞6h，收取上清，ELISA结果显示MAP27可刺激腹腔巨噬细胞分泌IL-6(MAP27 vs MAP(ctrl)，P=0.045; MAP27vs blank,P=0.018)、IL-1β(MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.002; MAP27 vs blank,P=0.000)，提示该合成肽在一定程度上模拟了PGN的生物学活性。
　　二、PGN模拟肽MAP27主动免疫保护作用
　　1.免疫方法4-6周，雌性BALB/c小鼠随机分为三组，分别以MAP27和MAP(ctrl)加弗氏佐剂进行免疫，两次免疫间隔2周，共进行5次，第三组小鼠同期饲养但未进行合成肽免疫，作为空白对照。合成肽末次免疫后第七天，以2×107CFU/只灭活菌加强免疫三组小鼠（包括空白组）一次。
　　2.MAP27免疫诱导小鼠体内产生低效价抗金葡菌抗体和抗PGN抗体每次免疫后一周检测血清效价。结果显示:与对照组相比，MAP27免疫组在免疫三次后即产生抗MAP27的IgG类抗体，效价达到1∶104，并可维持10周。灭活金葡菌加强免疫后，MAP27免疫组小鼠产生抗金葡菌超声裂解产物(MAP27 vsMAP(ctrl), P=0.000; MAP27 vs blank,P=0.000）及抗PGN(MAP27 vs MAP(ctrl),P=0.026; MAP27 vs blank，P=0.015)的IgG类抗体，但效价仅在1∶200倍。
　　3.在补体存在下，兔抗MAP27抗血清体外杀菌/抑菌作用以MAP27作为免疫原免疫新西兰兔获得抗血清，实验结果显示，在补体存在下兔抗MAP27抗血清产生对甲氧西林敏感株(MSSA，ATCC25923)较强的杀菌/抑制作用（MAP27免疫血清vs正常兔血清，P=0.000）。
　　4.MAP27免疫诱导小鼠抵御金葡菌系统性感染末次灭活菌加强免疫各组小鼠，5天后以致死剂量5×108CFU MSSA攻击(iv)，观察各组死亡率。MAP27免疫组小鼠7天内生存率为50％，空白对照组和MAP(ctrl)组小鼠分别在感染后第2天和第5天全部死亡(MAP27 vs MAP(ctrl)，P=0.000;MAP27 vs blank， P=0000);尾静脉注射亚致死剂量2×107CFU MSSA(ATCC25923)，感染3天后取各组小鼠肾脏、肺脏，研磨后检测脏器中细菌残存量，结果显示MAP27免疫组小鼠肾脏、肺脏中细菌载量显著低于对照组(MAP27 vs MAP(ctrl)，Pkidney=0.029, MAP27 vs blank, Pkidney=0.029;MAP27 vs MAP(ctrl), Plung=0.016,MAP27 vs blank，Plung=0.008)。提示MAP27免疫诱导小鼠抵御金葡菌系统性感染。
　　三、PGN模拟肽MAP27诱导保护性作用机制的研究
　　1.MAP27免疫组小鼠在感染早期脏器中IFN-γ、IL-17A/F和CCL3含量显著增高末次以灭活金葡菌加强免疫各组小鼠，尾静脉感染3天后取各组小鼠脏器，研磨后进行细胞因子检测，ELISA结果显示:与MAP(ctrl)组和空白对照组相比，MAP27免疫鼠脾脏、肺脏、肝脏IFN-γ(MAP27 vs MAP(ctrl)和IL-17A/F(MAP27 vs MAP(ctrl)水平明显升高;同时可有效激活巨噬细胞及中性粒细胞的趋化因子CCL3含量也明显增多，提示MAP27免疫可能通过激活T细胞免疫应答发挥保护作用。
　　2.MAP27免疫组小鼠在感染早期脾脏中IFN-γ+CD3+T细胞和IL-17+CD4+T细胞比例增高金葡菌感染3天后流式检测各免疫鼠脾脏胞内IFN-γ、IL-17A表达，提示感染早期诱导MAP27免疫鼠体内T细胞免疫应答。
　　3.体外实验表明，MAP27刺激免疫鼠脾细胞分泌Th1型细胞因子末次灭活菌加强免疫一次后第5天，分别取各组小鼠脾细胞，体外培养中以100μg/mlMAP27刺激各免疫组小鼠脾细胞24h，ELISA检测上清中细胞因子含量。结果表明MAP27免疫鼠脾细胞上清中IL-2、IFN-γ含量显著高于对照肽免疫组及空白对照组小鼠;未检测到IL-17A/F。ELISPOT结果显示低剂量MAP27及抗小鼠CD28抗体刺激MA27免疫鼠生成IFN-γ斑点形成细胞(spot-forming cells，SFCs)显著多于MAP(ctrl)免疫组和空白组(MAP27 vs MAP(ctrl)，P=0.001; MAP27 vs blank，P=0.001)，提示合成肽体外刺激可能诱导免疫鼠脾细胞产生相应的Th1型细胞免疫应答。
　　4.体外实验表明，灭活菌刺激MAP27免疫鼠脾细胞分泌Th1和Th17细胞因子天然抗原灭活菌体外刺激各免疫鼠脾细胞72h， ELISA结果示MAP27免疫鼠脾细胞上清中IL-2、IFN-γ和IL-17A/F含量显著高于对照肽免疫组和空白对照组，提示MAP27免疫组小鼠脾细胞可识别天然抗原并分泌Th1/Th17型细胞因子。
　　第二部分 LTA模拟肽筛选与鉴定
　　一、应用噬菌体展示技术筛选金葡菌LTA模拟肽克隆
　　1.噬菌体肽库筛选以抗LTA单抗为钓饵蛋白，分别采用固相法和液相法对噬菌体12线性肽库进行三轮筛选。固相法筛选富集率仅44倍，而液相筛选富集率可达300倍。从固相法所得第三轮洗脱产物中随机挑选65个噬菌体克隆，双夹心ELISA鉴定后得到18个与抗LTA单抗结合的阳性克隆;从液相法第三轮洗脱产物中随机挑选45个噬菌体克隆，夹心ELISA鉴定后仅得到4个与抗LTA单抗特异性结合的克隆。相较于固相筛选，液相筛选所得阳性克隆无非特异吸板序列。
　　2.阳性噬菌体测序及序列分析将固相法所得18个阳性噬菌体克隆进行测序，对氨基酸序列进行分析，共得到9个不同的序列。
　　二、模拟肽的合成及抗原性鉴定
　　选择含保守序列Hx或xx的阳性噬菌体克隆合成线性肽L3-1(HSVHxDFRQxxQPS(GGGS))和L2((HS)GHxDFRQxxQPS(GGGS))，HS、GGGS为起支架作用氨基酸残基，ELISA结果显示L3-1和L2均能以浓度梯度依赖方式和抗LTA单抗结合，且L3-1反应优于L2，故根据L3-1序列合成四分枝多价抗原肽，命名为MAP3，体外ELISA鉴定显示MAP3与抗LTA单抗能较好地结合。上述结果提示线性肽L3-1、L2及四分枝多价抗原肽MAP3模拟LTA的抗原表位，为后续研究提供基础。

目录

摘要

前言

第一部分 金黄色葡萄球菌非蛋白成分PGN模拟肽保护作用机制研究

第一章 PGN模拟肽合成与体外鉴定

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 小结

第二章 PGN模拟肽MAP27主动免疫的保护作用

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 MAP27诱导保护作用机制的研究

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第二部分 LTA模拟肽的初步筛选与鉴定

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 小结

全文总结

参考文献

中英文缩略词

致谢

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