腺病毒介导Foxo3a基因对顺铂所致的大鼠卵巢颗粒细胞及窦前卵泡损伤的研究

摘要

目的：卵巢早衰（Premature Ovarian Failure，POF）是指女性在40岁以前发生的以闭经、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高为特征的一种疾病。1.克隆大鼠Foxo3a基因并构建大鼠Foxo3a基因腺病毒过表达载体，包装纯化重组腺病毒;体外培养原代大鼠卵巢颗粒细胞，观察不同滴度重组腺病毒体外感染大鼠颗粒细胞的表达情况及表达效率。
　　2.探讨过表达Foxo3a基因对大鼠卵巢颗粒细胞体外发育的影响及调控机制，观察该基因对化疗药物顺铂诱导的卵巢颗粒细胞凋亡是否具有保护作用。
　　3.建立体外分离培养大鼠窦前卵泡系统，观察顺铂对其的毒性作用，并探讨重组腺病毒体外转染大鼠窦前卵泡的可行性及过表达Foxo3a基因对大鼠窦前卵泡体外发育的影响。
　　方法：1.重组腺病毒构建:在Genebank中查询大鼠Foxo3a基因序列，合成大鼠Foxo3a cDNA序列，克隆至pUC57载体中;选取经酶切电泳分析及DNA测序鉴定正确的大鼠Foxo3a基因，经过质粒提取、酶切连接反应连接到腺病毒载体质粒pDC315中，构建重组腺病毒载体pDC315-rFoxo3a;通过酶切电泳分析和测序进一步验证目的基因的正确性后，将携带目的基因的重组质粒和骨架质粒共转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞，包装出重组腺病毒AD-rFoxo3a，进行测序验证和滴度测定（TCID50法）。
　　2.体外分离培养大鼠原代卵巢颗粒细胞，利用HE染色及FSHR免疫荧光法进行原代颗粒细胞鉴定，确定重组腺病毒体外感染大鼠卵巢原代颗粒细胞最佳感染复数(MOI)，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹(Westernblot)方法检测目的基因Foxo3a的表达情况。
　　3.实验分为3组:实验组(重组腺病毒AD-rFoxo3a)、阴性对照组（空载腺病毒rAD）及空白对照组。观察各组细胞生长增殖情况并绘制细胞生长曲线;利用Western-blot法检测各组细胞中cyclinD1、p27、Bax、Bim蛋白表达;利用流式细胞术、Hoechst33342/PI染色法分别检测各组细胞的细胞周期及细胞凋亡情况。各组转染48h后加入最适浓度的顺铂，观察各组细胞生长状况，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况。
　　4.体外分离培养大鼠窦前卵泡(直径120-150μm)，实验分组同前（30个卵泡/组）。利用不同滴度的重组腺病毒体外转染卵泡，观察卵泡生长发育形态及绿色荧光蛋白EGFP和目的蛋白Foxo3a的表达情况;各组转染一定时间后加入最适浓度的顺铂，观察各组卵泡形态学变化及闭锁情况。
　　结果：1.本实验构建的携带大鼠Foxo3a基因的质粒经酶切电泳可见约2000bp DNA条带，与Genebank中大鼠Foxo3a基因片段长度(2019bp)一致，经测序鉴定后行同源性分析为99％。重组腺病毒质粒pDC315-rFoxo3a经酶切鉴定及测序证实重组质粒构建成功。重组腺病毒质粒以及骨架质粒共转染293T细胞15d可见病毒空斑，培养21d收毒，经病毒扩增后行琼脂糖电泳鉴定及DNA测序证明重组腺病毒AD-rFoxo3a构建成功，测定滴度为1.106×1010 PFU/mL。
　　2.分离培养的大鼠原代卵巢颗粒细胞经鉴定表明细胞纯度及存活率均＞90％。当MOI为50时，重组腺病毒对颗粒细胞的感染效率最高，且对细胞无明显毒性。RT-PCR法检测结果发现实验组Foxo3amRNA表达量明显高于对照组，且在转染后36h表达水平最高;Western-blot法检测结果发现实验组有分子量约80KD蛋白的表达，而对照组中无表达。
　　3.(1)通过绘制生长曲线结果发现，实验组卵巢颗粒细胞生长较对照组受到抑制，而空白对照组及阴性对照组颗粒细胞生长良好，呈现S型生长曲线，两组细胞增值率无明显差异;(2)流式细胞仪检测细胞周期结果显示:实验组细胞在G1期的比例较对照组明显增加，S期细胞所占比例明显减少（P均＜0.01）;(3)流式细胞仪检测细胞凋亡及Hoechst33342/PI染色结果发现:实验组细胞凋亡率较对照组增加(P＜0.01)，而空白对照组及阴性对照组之间细胞凋亡率无明显差异。(4)Western-blot检测相关蛋白结果发现:实验组Bim、p27、CyclinD1蛋白较对照组明显高表达，空白对照组和阴性对照组之间各个蛋白表达无差异;同时，各组均为发现明显Bax蛋白表达;(5)各组细胞加入顺铂24h后行流式细胞仪检测结果发现，实验组卵巢颗粒细胞凋亡率高于空白对照组及实验对照组(P＜0.01)，后两组细胞凋亡率差异无统计学意义。
　　4.机械法联合酶消化法分离的大鼠窦前卵泡体外培养24h可贴壁，平均培养7d后出现卵母细胞逸出、基底膜破裂等卵泡闭锁表现，在加入顺铂后卵泡闭锁率明显增加。用不同滴度的重组腺病毒体外转染大鼠窦前卵泡结果显示，卵泡内部及基膜表面均未见明显绿色荧光蛋白表达，RT-PCR法未检测Foxo3a的表达。
　　结论：1.本实验成功构建了大鼠重组慢病毒AD-rFoxo3a，具有滴度高、体外转染细胞效率高的特点，并能成功感染体外培养的大鼠原代卵巢颗粒细胞，使目的基因Foxo3a在细胞中得以有效转录及表达，为进一步研究该基因的对卵巢颗粒细胞的调控作用及对化疗药物导致的卵巢功能衰退的防治奠定了基础。
　　2.过表达Foxo3a基因在体外可通过促进cyclinD1、p27蛋白表达促使大鼠卵巢颗粒细胞周期停滞在静止期，并可通过促进Bim蛋白表达诱导卵巢颗粒细胞凋亡;同时，本实验未发现过表达Foxo3a基因可以逆转顺铂诱导卵巢颗粒细胞凋亡的作用。
　　3.重组腺病毒对体外培养的大鼠窦前卵泡转染效率极低下，可能因病毒无法通过卵泡表面的基底膜以及体外环境缺少相关因子刺激有关;同时本实验未观察到重组腺病毒AD-rFoxo3a与卵泡共培养对顺铂的卵泡毒性有保护作用。
　　4.关于Foxo3a基因对卵泡发育和闭锁的调控以及卵巢功能的影响还有赖于体内实验进一步明确。

目录

摘要

前言

第一章 构建携带大鼠Foxo3a基因的重组腺病毒

一、引言

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、讨论

第二章 过表达Foxo3a基因调控大鼠颗粒细胞体外发育及预防顺铂毒性作用的研究

第一节 大鼠原代卵巢颗粒细胞培养及重组腺病毒感染效率的研究

一、引言

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

第二节 过表达Foxo3a基因对卵巢颗粒细胞体外发育的影响及机制

一、引言

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

第三节 过表达Foxo3a基因对顺铂细胞毒性保护作用的研究

一、引言

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

讨论

第三章 大鼠窦前卵泡体外培养及顺铂与携带Foxo3a基因的腺病毒共培养的结果观察

一、引言

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、讨论

全文小结

参考文献

中英文对照与缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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