一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用

摘要

本发明涉及一种shRNA，特别涉及一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用。编码所述shRNA的DNA序列，如下所示：5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAGTTC C-3’，所述的GCAAGAG为loop序列。所述的有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的应用包括将所述的shRNA构建于慢病毒载体上，得到含有所述shRNA的重组载体；将含有所述shRNA的重组载体作用于大鼠细胞，达到抑制大鼠FoxO3a基因表达的目的。该shRNA能有效抑制大鼠FoxO3a基因在mRNA及蛋白水平的表达。

说明书

技术领域

本发明涉及一种shRNA，特别涉及一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的 shRNA及其应用。

背景技术

FoxO3a是属于Forkhead box(Fox)蛋白家族的一个核转录因子，可通过调 节Bim、Fas ligand(FasL)、TNFR2、p27、p53、抗氧化物酶等多种下游靶基 因的转录而发挥促细胞凋亡、细胞周期阻滞及抗氧化等不同的生物学功能。目 前研究认为，FoxO3a广泛分布于哺乳动物的多种组织和细胞中，并参与糖代谢、 骨骼肌的分化发育、血管发生、抑制细胞增殖、抑制心肌肥厚等生理和病理过 程。因此，研究不同病理及生理条件下FoxO3a转录因子的功能越来越受到人们 的广泛关注。

随着RNA干扰技术的不断深入发展，将设计合成的shRNA构建到慢病毒 表达系统，进而感染特定的靶细胞，特异性沉默相关基因表达，已经成为研究 基因功能的最有效的手段之一，也是靶向基因治疗的有效途径。shRNA慢病毒 表达系统有效克服了以往人工合成的siRNA转染效率低、持续时间短等不足， 已经逐步发展成为在原代细胞及体内研究基因功能的有效途径之一。针对大鼠 FoxO3a基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的慢病毒表达系统，为今后 深入研究大鼠FoxO3a基因的功能奠定了基础，可广泛应用于FoxO3a基因相关 的大鼠细胞及动物模型，具有重要的应用前景和经济价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效抑制大 鼠FoxO3a基因表达的shRNA。

本发明的另一目的在于提供上述有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA 的应用。

本发明的再一目的在于提供一种含有上述shRNA的重组载体。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA，其靶向大鼠FoxO3a基因的 序列如下所示：5’-GGA ACT TCA CTG GTG CTA AGC-3’，位于大鼠FoxO3a 基因mRNA(NM-001106395.1)的2296位点开始的21个碱基序列；

编码所述的抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的DNA序列，如下所示：

5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCTTAGCACCAGTGAAGTT  CC-3’，斜体加下划线为loop序列；

所述的有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的应用，该应用包括将所 述的shRNA构建于慢病毒载体上，得到含有所述shRNA的重组载体；将含有 所述shRNA的重组载体作用于大鼠细胞，达到抑制大鼠FoxO3a基因表达的目 的；

所述慢病毒载体为pGLV3/H1/GFP+Puro(pGLV3)慢病毒穿梭载体；

所述的含有所述shRNA的重组载体的制备方法，包含以下步骤：

(1)设计含有抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的DNA序列，如下所 示：

5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCTTAGCACCAGTGAAGTT  CC-3’，斜体加下划线为loop序列；

为将其克隆到pGLV3慢病毒穿梭载体上，合成以下正义链(F)及反义链(R) DNA序列：

FoxO3a-shRNA-2296正义链：

5’-GATCCTTTTTTG-3’；

FoxO3a-shRNA-2296反义链：

3’-GAAAAAACTTAA-5’；

上述正义链模板的5’端添加了GATCC，与BamH I酶切后形成的粘端互补； 反义链模板的5’端添加了AATTC，与EcoR I酶切后形成的粘端互补；

(2)将等量的正义链和反义链DNA混合，进行退火，以形成DNA双链， 得到shRNA模板；

(3)将pGLV3载体用BamH I和EcoR I双酶切，得到线性化的pGLV3载 体；

(4)将步骤(2)中的shRNA模版和步骤(3)中线性化的pGLV3载体进 行连接，得到重组载体pGLV3-FoxO3a-shRNA；

步骤(2)中所述的shRNA模板的终浓度优选为200nM；

步骤(3)中所述的线性化的pGLV3载体的终浓度优选为50ng/μL；

将重组载体pGLV3-FoxO3a-shRNA与包装载体pGag/Pol、pRev、pVSV-G 一起倒入293T细胞，收集培养上清获得含有目的shRNA的病毒颗粒，可用于 转染目的细胞。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明所述抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA能有效抑制大鼠FoxO3a 基因在mRNA及蛋白水平的表达。将所述抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA 构建于慢病毒载体上，不仅可有效作用于分裂及非分裂状态的细胞，也适用于 体内及体外研究。同时，对于深入研究大鼠FoxO3a基因的功能及其相关疾病的 治疗均具有重要的科学意义及应用前景。

附图说明

图1是本发明所设计的靶向抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的设计位 点对比图。

图2是用荧光显微镜检测将重组载体导入原代大鼠心脏微血管内皮细胞的 效率图。

图3是利用Western blotting技术检测转染4种重组慢病毒载体后大鼠细胞 中内源性FoxO3a蛋白表达水平分析图，其中，A为所设计的4种shRNA对 FoxO3a蛋白表达抑制的Western Blotting分析；B为FoxO3a蛋白的相对表达量 统计分析；C为4种shRNA对FoxO3a蛋白表达的抑制率统计分析。

图4是用RT-PCR技术检测大鼠细胞中内源性FoxO3a基因mRNA被抑制 情况分析图，其中，A为电泳检测FoxO3a的mRNA表达；B为 FoxO3a-shRNA-2296抑制FoxO3a的mRNA表达的统计分析。

图5是利用Western blotting技术检测大鼠心脏微血管内皮细胞导入重组质 粒后FoxO3a下游靶基因p27的表达分析图，其中，A为本发明所述的shRNA 对p27蛋白表达抑制的Western Blotting分析；B为FoxO3a-shRNA-2296抑制p27 蛋白表达的统计分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。

实施例1shRNA序列的设计与合成

(1)通过GeneBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)查询大 鼠FoxO3a基因的mRNA信息，根据shRNA设计原则，设计了4条针对大鼠 FoxO3a基因的FoxO3a-shRNA序列，并将上述设计完成的shRNA序列送生工 生物(上海)有限公司合成。其中4条shRNA分别为靶向大鼠FoxO3a基因 (NM_001106395.1)的1012位点、1765位点、1903位点及2296位点，长为 21个碱基(图1)。

其中，本发明所涉及的FoxO3a-shRNA-1012的作用位点序列为：5‘-GCA  AGA GCT CTT GGT GGA TCA-3’；FoxO3a-shRNA-1765的作用位点序列为： 5‘-GCC ACA GCG ATG TCA TGA TGA-3’；FoxO3a-shRNA-1903的作用位点序 列为：5‘-GGA GTT TGG TCA ATC AGA ACT-3’；FoxO3a-shRNA-2296的作用 位点序列为：5‘-GGA ACT TCA CTG GTG CTA AGC-3’。

根据上述4中shRNA的作用位点序列设计合成相应的shRNA的正义与反 义链DNA序列：

FoxO3a-shRNA-1012正义链：

5’-GATCCTTTTTTG-3’；

FoxO3a-shRNA-1012反义链：

3’-GAAAAACTTAA-5’；

FoxO3a-shRNA-1765正义链：

5’-GATCCTTTTTTG-3’；

FoxO3a-shRNA-1765反义链：

3’-GAAAAACTTAA-5’；

FoxO3a-shRNA-1903正义链：

5’-GATCCTTTTTTG-3’；

FoxO3a-shRNA-1903反义链：

3’-GAAAAACTTAA-5’；

FoxO3a-shRNA-2296正义链：

5’-GATCCTTTTTTG-3’；

FoxO3a-shRNA-2296反义链：

3’-GAAAAACTTAA-5’；

上述正义链模板的5’端添加了GATCC，与BamH I酶切后形成的粘端互补； 反义链模板的5’端添加了AATTC，与EcoR I酶切后形成的粘端互补。

(2)将等量的正义链(100μM，5μL)和反义链(100μM，5μL)DNA混 合，加入5倍的Annealing Buffer for DNA Oligos(10μL,Beyotime)，然后用去离 子水补充到50μL。在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min，然后 以每8秒下降0.1℃的速率降至25℃进行退火，最后4℃保存备用。将退火后 所得shRNA模板溶液稀释50倍，使其终浓度为200nM，用于连接反应。

(3)将pGLV3载体(吉玛基因股份有限公司)用BamH I和EcoR I双酶切， 进行载体的线性化处理，酶切条件如下所述：将pGLV3载体(10μg)、BamH I 内切酶(5μL，TOYOBO)、EcoR I内切酶(5μL，TOYOBO)、H buffer(80μL， TOYOBO)混匀，置于37℃反应1小时，用凝胶回试剂盒(Qiagen)回收线性 载体片段，将其浓度稀释至50ng/μL。

(4)将线性化的pGLV3载体1μL、经退火处理的shRNA模版1μL、T4DNA 连接酶(Fermentas)1μL、10×T4连接缓冲液(Fermentas)2μL、去离子水15μL 混匀，于22℃连接1小时。取连接产物2μL转化大肠杆菌Top10感受态细胞 (TIANGEN)，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上于30℃培养过夜。挑 选长出的单克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于30℃培养 过夜，用质粒抽提试剂盒(Qiagen)纯化质粒，经测序验证后大量制备重组质粒 pGLV3-FoxO3a-shRNA。

(5)将重组载体pGLV3-FoxO3a-shRNA与包装载体pGag/Pol、pRev、pVSV-G (吉玛基因股份有限公司)一起倒入293T细胞(ATCC，美国)，收集培养上清， 获得含有目的shRNA的病毒颗粒。

实施例2重组慢病毒载体感染原代大鼠心脏微血管内皮细胞的效率

将表达上述4种shRNA的慢病毒颗粒转染SD大鼠(购买于广东省医学实验动 物中心)心脏微血管内皮细胞(Cao L,Zhang L,Chen S,Yuan Z,Liu S,Shen X, Zheng X,Qi X,Lee KK,Chan JY,Cai D.BDNF-mediated migration of cardiac  microvascular endothelial cells is impaired during ageing.J Cell Mol Med,2012, 16(12):3105-15)，利用荧光显微镜技术检测不同shRNA的感染效率。

(1)实验分组：实验分为空白对照组、FoxO3a-shRNA-1012感染组、 FoxO3a-shRNA-1765感染组、FoxO3a-shRNA-1903感染组、FoxO3a-shRNA-2296 感染组等共5组，所有组别的细胞数量及培养条件一致；

(2)具体感染方法：将1×10⁵个细胞与5×10⁶TU病毒颗粒混合于500μL的 EGM-2(LONZA)完全培养基中(内含5％的FBS+双抗+5μg/mL的polybrene)， 并接种于24孔板，于37℃的培养箱中培养12小时，去除原有培养基，并加入新 鲜的EGM-2完全培养基继续培养；

(3)荧光显微镜检测：细胞感染72小时后进行荧光显微镜观察并进行拍照。 结果表明，与对照组相比，所设计合成的4种shRNA慢病毒载体均能有效感染原 代的大鼠心脏微血管内皮细胞，感染率均在80％以上，其中FoxO3a-shRNA-2296 的感染效率最高，感染效率依次为：FoxO3a-shRNA-2296>FoxO3a-shRNA-1012> FoxO3a-shRNA-1765>FoxO3a-shRNA-1903(图2)。

实施例3重组慢病毒载体对大鼠心脏微血管内皮细胞中内源性FoxO3a蛋白 表达的抑制作用

利用Western blooting技术检测4种shRNA对大鼠心脏微血管内皮细胞内 源性FoxO3a蛋白表达水平的影响。

(1)实验分组：实验分为空白对照组、FoxO3a-shRNA-1012感染组、 FoxO3a-shRNA-1765感染组、FoxO3a-shRNA-1903感染组、FoxO3a-shRNA-2296 感染组等共5组。所有组别的细胞数量及培养条件一致，感染组均用同样的病毒 量(MOI＝50)进行处理。

(2)Western blooting检测：细胞感染72小时后，利用蛋白质裂解液(碧 云天)提取总蛋白质，利用Bio-Rad公司生产的蛋白质浓度测定试剂测定其蛋白 浓度。具体实验方法请参照文献(Xu-Feng Qi,Dong-Heui Kim,Yang-Suk Yoon, Jian-Hong Li,Soon-Bong Song,Dan Jin,Xue-Zhu Huang,Yung-Chien Teng, Kyu-Jae Lee.The adenylyl cyclase-cAMP system suppresses TARC/CCL17and  MDC/CCL22production through p38MAPK and NF-кB in HaCaT keratinocytes. Mol Immunol,2009,46(10):1925-1934.)执行，使用anti-FoxO3a抗体(Cell  Signaling Technology)及β-actin抗体(Cell Signaling Technology)进行检测， 并用IPP软件对蛋白条带进行灰度分析。结果表明，FoxO3a-shRNA-1012及 FoxO3a-shRNA-2296均对内源性大鼠FoxO3a基因的表达具有较强的抑制作用， FoxO3a-shRNA-2296的抑制效率最高，达99％；FoxO3a-shRNA-1012的抑制效 率也达到97％；FoxO3a-shRNA-1765的抑制效率达到80％，而 FoxO3a-shRNA-1903几乎没有任何抑制效果(图3)。

实施例4FoxO3a-shRNA-2296对大鼠心脏微血管内皮细胞FoxO3a基因 mRNA表达的影响

利用FoxO3a-shRNA-2296对SD大鼠(购买于广东省医学实验动物中心)心 脏微血管内皮细胞(Cao L,Zhang L,Chen S,Yuan Z,Liu S,Shen X,Zheng X,Qi X, Lee KK,Chan JY,Cai D.BDNF-mediated migration of cardiac microvascular  endothelial cells is impaired during ageing.J Cell Mol Med,2012,16(12):3105-15)进 行感染(MOI＝50)，48小时后收集总RNA样品。以未进行任何处理的细胞作为 空白对照。通过RT-PCR技术检测了大鼠心脏微血管内皮细胞中FoxO3a的mRNA 表达情况。具体实验方法为：用TRI reagent(Molecular Research Center Inc., Cincinnati,USA)提取细胞的总RNA，用A260与A280检测其质量，用Prime RT  Premix kit(GeNet Bio,Chungnam,Korea)合成cDNA。所用RT-PCR引物序列为：

FoxO3a上游引物：5’-TCG CGC ACC AAT TCC AAC-3’；

FoxO3a下游引物：5’-TCG CTG TGG CTG AGT GAG TC-3’；

β-actin上游引物：5’-GCA CCA CAC CTT CTA CAA TGA G-3’；

β-actin下游引物：5’-TTG GCA TAG AGG TCT TTA CGG A-3’；

PCR反应用Prime Taq Premix kit(GeNet Bio,Chungnam,Korea)试剂盒完成， 反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、56～65℃退火30秒、72℃ 延伸30秒，30个循环；72℃延伸7分钟。PCR产物用质量百分比2％的琼脂糖 凝胶进行电泳并拍照。结果表明，大鼠心脏微血管内皮细胞中存在FoxO3a基因 的内源性表达，而FoxO3a-shRNA-2296感染可有效抑制FoxO3a基因的mRNA 表达水平，说明本发明所述shRNA可在mRNA水平上有效抑制靶基因FoxO3a 的表达(图4)。

实施例5FoxO3a-shRNA-2296感染对大鼠心脏微血管内皮细胞中FoxO3a 下游靶基因p27表达的影响

p27蛋白是转录因子FoxO3a下游的经典靶基因之一，FoxO3a的活性升高可 导致其靶基因p27的表达升高、活性增强。为进一步验证本发明所述shRNA对 FoxO3a基因的靶向抑制作用，同时利用Western blooting技术检测了 FoxO3a-shRNA-2296感染对大鼠心脏微血管内皮细胞中p27蛋白表达的影响。所 用p27及β-actin抗体均购置于Cell Signaling公司。Western blooting技术的具体 实验方法参照实施例3。结果表明，FoxO3a-shRNA-2296感染可有效抑制FoxO3a 下游靶基因p27蛋白的表达水平(图5)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。