过表达C/EBPα与PU.1对jurkat细胞株生物学性状改变的影响

摘要

白血病是因造血干/祖细胞在分化过程中的不同阶段发生分化障碍，增殖旺盛、凋亡受到抑制从而引起的造血系统恶性肿瘤[1]。越来越多的研究认为白血病的发生遵循“二次打击”学说[2]。急性白血病(AL)的发生源于不同类型的基因同时发生突变。在众多的转录因子中，CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)及CCAAT增强子结合蛋白A(CEBPA)基因通过促进造血干/祖细胞向粒系分化并抑制细胞增殖，在造血系统早期分化过程中起重要作用[5，6]。C/EBPα在造血细胞自身的增殖、凋亡、细胞周期、细胞分化等方面具有高度的调节作用[7]，C/EBPα在急性髓系白血病中发挥着原癌基因的作用，在急性淋巴细胞白血病中发挥着抑癌基因的作用。CEBPA基因的突变及其在转录、翻译及翻译后水平受到的异常调控可引起C/EBPα结构异常，从而导致粒系细胞分化成熟的障碍、不成熟粒系前体细胞异常地增殖，这是急性髓系白血病(AML)的重要发病机制。
　　转录因子PU.1是Ets家族的一员，Kueh[8]等认为B细胞的成熟有赖于PU.1表达的降低，而巨噬细胞的形成则有赖于PU.1表达的升高，同时PU.1在调节造血细胞的周期中也起着重要的作用。另外，PU.1与C/EBPα作用相似，在急性髓系白血病中发挥着原癌基因的作用，在急性淋巴细胞白血病中发挥着抑癌基因的作用。在急性B淋巴细胞白血病原始细胞中，过表达C/EBPα与PU.1，原始B细胞也能向巨噬细胞转化，且具有完整的趋化和吞噬的功能[15,16]。临床工作中，偶尔会出现急性淋巴细胞白血病与急性髓系白血病之间的转化，或是重型再障异基因移植后向急性髓系白血病或骨髓增生异常综合征(MDS)的转化，除外放化疗药物的影响[17]，转录因子C/EBPα与PU.1的相互作用是否能部分解释此种现象呢。
　　目的:
　　本研究以急性淋巴细胞白血病jurkat细胞株为对象，通过逆转录病毒载体(pwpxld-gfp、pwpxld-C/EBPα-gfp、pwpxld-PU.1-gfp、pwpxld-C/EBPα-PU.1-gfp)转染jurkat细胞株，建立稳定表达C/EBPα、PU.1与共表达C/EBPα、PU.1的细胞株（以下简称jurkat-C/EBPα-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp），并研究过表达C/EBPα与PU.1后对jurkat细胞株增殖、凋亡、细胞表面标志抗原的变化等生物学性状的影响。将细胞(jurkat-gfp、jurkat-C/EBPα-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp)通过尾静脉注射入免疫缺陷的NSI小鼠体内，观察小鼠生物学行为的改变、生存时间及各脏器白血病细胞侵犯的程度。从体外和体内实验两方面研究急性淋巴白血病jurkat细胞株能否通过转录因子表达的增高向单核巨噬细胞转化，从而降低致癌性，延长生存期，同时也部分解释临床上急淋与急非淋相互转化的机制，为更深层次了解白血病做基础。
　　材料和方法:
　　将已构建好的逆转录病毒载体扩大培养，提取质粒并进行酶切鉴定。将获得的重组病毒载体pwpxld-gfp，pwpxld-C/EBPα-gfp，pwpxld-PU.1-gfp，pwpxld-C/EBPα-PU.1-gfp质粒转化至DH5α感受态细菌中，均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，倒置放置于37度孵箱中培养过夜。次日挑取单个菌落，放置于2ml含有氨苄青霉素LB的液体培养基中，放置于摇床上，37度，210转/分，培养12-16h。提取质粒，酶切鉴定，明确已构建好的逆转录病毒载体是否正确，有无发生突变。采用脂质体法，将酶切鉴定正确的质粒通过293T细胞包装病毒，收集病毒上清，感染jurkat细胞株，建立过表达C/EBPα与PU.1的jurkat细胞系，并通过QRT-PCR法鉴定转录因子的表达。通过检测细胞增殖、细胞凋亡、细胞表面标志抗原的变化等了解C/EBPα、PU.1对jurkat生物学性状的影响。通过粒系相关细胞因子(GM-CSF、M-CSF、IL-3、FLT-3L)的辅助，观察过表达转录因子的细胞能否转化为贴壁的巨噬细胞，并以瑞氏染色的酵母菌检测巨噬细胞趋化和吞噬的功能，RT-PCR法检测巨噬细胞相关髓系基因的表达，细胞学染色、化学染色观察细胞形态，有无髓系标志，并使用BCIP/NBT试剂盒检测巨噬细胞碱性磷酸酶的存在。将过表达C/EBPα、PU.1的细胞通过尾静脉注射入免疫缺陷小鼠体内，观察小鼠生物学行为的改变以及生存时间。通过流式细胞仪检测各脏器白血病细胞侵犯的程度，细胞化学染色、免疫组化等方法观察细胞的转化程度，进一步验证转录因子C/EBPα、PU.1对急性淋巴细胞白血病jurkat细胞株生物学性状的改变。
　　1、逆转录病毒载体酶切鉴定。将逆转录病毒载体pwpxld-gfp，pwpxld-C/EBPα-gfp，pwpxld-PU.1-gfp，pwpxld-C/EBPα-PU.1-gfp在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养12-16h后，应用质粒提取试剂盒提取质粒，测定质粒浓度。根据质粒图谱选择适当的快切酶进行双酶切，37度在孵箱孵育30min后，选择合适的DNA Marker，1％凝胶220v电压，40min电泳，观察条带的大小并拍照。
　　2、逆转录病毒包装，转染jurkat细胞株及转录因子相对表达量的测定。通过脂质体法三质粒包装系统利用293T细胞包装病毒，观察293T细胞在荧光显微镜下gfp表达情况，收集24h，48h，72h病毒上清，感染jurkat细胞。感染后48h在荧光显微镜下观察gfp表达情况，72h后应用流式细胞仪分选gfp阳性的jurkat细胞，培养后将处于对数生长期的jurkat细胞提取RNA，逆转录为cDNA，QRT-PCR法鉴定jurkat-gfp、jurkat-C/EBPα-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp等四种细胞C/EBPα、PU.1的表达情况。
　　结果:
　　1.将已构建好的逆转录病毒载体pwpxld-gfp，pwpxld-C/EBPα-gfp，pwpxld-PU.1-gfp，pwpxld-C/EBPα-PU.1-gfp质粒扩大培养后，经酶切鉴定，电泳后比对质粒图谱，电泳条带大小正确，证实质粒结构正确，无突变。
　　2.脂质体法利用三质粒病毒包装系统将pwpxld-gfp，pwpxld-C/EBPα-gfp，pwpxld-PU.1-gfp，pwpxld-C/EBPα-PU.1-gfp质粒转入293T细胞中，24h即可看到有绿色荧光表达。将收集后的病毒上清感染jurkat细胞，48h后可检测到jurkat-gfp细胞gfp表达量约为100％，jurkat-PU.1-gfp细胞gfp表达量约为80％,jurkat-C/EBPα-gfp细胞gfp表达量约为60％,jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp细胞gfp表达量约为20％。应用流式分选仪分选gfp阳性细胞后，提取RNA，逆转录为cDNA，通过QRT-PCR法证实jurkat-C/EBPα-gfp组C/EBPα表达量为jurkat-gfp的5倍，jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp组C/EBPα表达量为jurkat-gfp的4倍。Jurkat-PU.1-gfp组PU.1的表达量为jurkat-gfp的3.5倍，jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp组PU.1的表达量为jurkat-gfp的1.5倍。jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp组PU.1的表达量为C/EBPα表达量的6倍。
　　3.流式细胞术结果显示:分选gfp阳性细胞后扩大培养，jurkat-gfp组CD3阳性率约为90％，CD11b几乎不表达，jurkat-PU.1-gfp组CD3阳性率可降至40％，CD11b阳性率最高达30％，jurkat-C/EBPα-gfp组CD3阳性率可降至70％，CD11b基本不表达，jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp组CD3阳性率可降至20％，CD11b阳性率最高达10％，各组CD3和CD11b表达量差异有统计学意义（P＜0.001,P＜0.001）。
　　结论:
　　对人急性淋巴细胞白血病细胞株jurkat过表达C/EBPα、PU.1后，细胞表面标志抗原CD3表达降低，CD11b表达升高，jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp组CD3阳性率最低，jurkat-PU.1-gfp组CD11b阳性率最高。过表达C/EBPα后，细胞增殖明显减慢，凋亡明显增加。在细胞因子GM-CSF、M-CSF、IL-3、FLT-3L的辅助下，jurkat-C/EBPα-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp组细胞均能转化为贴壁的巨噬细胞，伸出伪足，且转化的巨噬细胞能够趋化并吞噬酵母菌，且细胞存在碱性磷酸酶。jurkat-C/EBPα-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPα-PU.1-gfp组及转化后的巨噬细胞均低表达淋系相关基因，弱表达或高表达髓系相关基因。过表达C/EBPα与PU.1后在免疫缺陷NSI小鼠体内，jurkat能部分转化为巨噬细胞，降低jurkat的致癌性，延长小鼠的生存时间。

目录

摘要

前言

第一章 过表达C／EBPα与PU．1的急性淋巴细胞白血病jurkat细胞株的构建及鉴定

1 材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

第二章 过表达C／EBPα、PU．1对急性淋巴细胞白血病jurkat细胞株的体外生物学性状改变的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 过表达C／EBPα、PU．1的jurkat细胞株的体内生物学活性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第四章 全文小结

第五章 本文创新与展望

成果

致谢

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