抑制肝内胆管癌细胞增殖的表观遗传学药物筛选及HC toxin对CCLP-1细胞的作用机制研究

摘要

目的:
　　肝内胆管癌(Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC)是原发于肝脏的恶性肿瘤，来源于次级胆管远端微小胆管的上皮细胞，其恶性程度很高、预后差;虽然发病率不高，约占原发性肝癌的10％～20％，占所有胆管癌的10％，但近几十年来呈上升趋势，尤其是西方国家。目前，手术仍是主要的治疗方法，但是由于其临床症状不明显，早期诊断很困难，限制了根治性手术的开展，对于不能手术的ICC患者，肝脏移植在远期效果上还存在很大的争议。化疗方面，胆道肿瘤化疗方案多以采用顺铂+吉西他滨疗效较好，但对于ICC还没有大型的临床研究数据支持。由于ICC微环境丰富、异质性差别大，而且具有很强的促结蹄组织增殖能力，这使得其对一般的化疗容易产生耐受性。因此寻找敏感的化疗药物，解决化疗耐受性问题，对于治疗ICC具有十分重要的意义。
　　表观遗传学机制主要包含脱氧核糖核酸（DNA）的甲基化、非编码核糖核酸(RNA)调节、组蛋白修饰、基因与蛋白的磷酸化过程以及溴蛋白结构域修饰等，它们在环境因素影响的疾病中起着很重要的作用，在ICC的病理生理过程中，多种表观遗传学机制也发挥了重要的作用。目前，针对表观遗传学机制开发的药物被认为在治疗癌症、心脑血管慢性疾病和精神神经等疾病中具有巨大潜力，并且有很多药物已经进入各期临床研究。而应用于ICC治疗的基础及应用研究还属于相对空白的区域。因此从表观遗传学位点调控出发，开发的表观遗传学药物在治疗ICC方面可能具有很好的前景，而组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylase,HDAC)抑制剂HC toxin(Helminthosporium carbonum toxin, HCtoxin)可能成为其中的一种。
　　近年来发现Notch信号通路的激活可使成熟的肝细胞转变成ICC前体细胞，这使得Notch信号通路在ICC的发病机制上的研究受到极大的关注，同时，Notch通路也受到了表观遗传学方面的调控，尤其是HDAC修饰对该通路的影响存在不小的争议，这提示我们在开发HDAC相关类药物用以治疗ICC时必须考虑其对Notch通路可能的影响。
　　基于以上研究背景，本课题分为三组实验，主要目的有三:
　　实验一:针对ICC细胞株，进行表观遗传学药物的筛选，得出对ICC细胞较为敏感的药物，为ICC的新药物化疗提供前期实验基础。
　　实验二:探讨HDAC抑制剂HC Toxin对ICC细胞的在增殖、细胞周期、凋亡等多方面生物学功能上的影响。
　　实验三:探讨HDAC抑制剂HC Toxin对ICC细胞Notch信号通路的影响。
　　方法:
　　针对三组实验，分别采用以下方法完成
　　实验一:
　　1.针对ICC细胞株RBE，采用CCK-8细胞活力检测法，对Cayman公司提供的表观遗传学药物文库No.11076，进行单一时间点的药物初步筛选。
　　2.用CCK-8细胞活力检测，将上诉初步筛选所得出的敏感药物以及吉西他滨(Gemcitabine)对HuCCT1、CCLP-1、TFK-1、RBE等多种ICC细胞进行处理，在多浓度梯度上作抑制效果的比较，并确定其半数有效抑制率。
　　实验二:
　　1.用细胞计数法及平板细胞克隆形成实验，检测HC Toxin对ICC细胞系CCLP-1增殖及克隆形成能力的影响。
　　2.用光学显微镜下观察吉姆萨染色前后HC Toxin对ICC细胞CCLP-1的形态学影响，探索该过程中可能的生物学过程。
　　3.用7-AAD染色的流式细胞技术，检测ICC细胞CCLP-1经HC toxin处理一定时间后的细胞周期的分布，探索HC toxin对ICC细胞周期的影响。
　　4.用AnnexinⅤ FITC和7-AAD联合染色的流式细胞技术，检测ICC细胞CCLP-1经HC toxin处理一定时间后细胞的凋亡情况，探索HC toxin对细胞凋亡的影响。
　　实验三:
　　1.用反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ICC细胞CCLP-1经HC toxin处理一定时间后Notch1等部分重要基因转录情况变化。
　　2.用细胞免疫荧光试验(Immunofluorescence，IF)及蛋白免疫印迹法(Western Blot)，检测ICC细胞CCLP-1经HC toxin处理一定时间后Notch通路相关蛋白notch1、Hes1等的表达变化。
　　3.用CCK-8细胞活力检测法，检测Notch通路抑制剂DAPT单独或联合HCtoxin对CCLP-1的细胞活力的影响。
　　结果:
　　实验一:
　　1.所选表观遗传学文库共有95种表观遗传学药物，其中27 uM的高浓度药物作用下，有22种表观遗传学药物对RBE细胞有抑制作用，包括HDAC抑制剂12种(HCToxin, TSA, SAHA,4-iodo-SAHA, SB939, CAY10398, M344, ITF2257，Oxamflatin，Scriptai，CBHA，CAY10603);组蛋白甲基化转移酶抑制剂3种(Chaetocin，GSK343，BIX01294);组蛋白去甲基化转移酶抑制剂2种(PFI-1，GSK-J4);磷酸化抑制剂2种（Bromosporine，JQ1）;溴蛋白结构域抑制剂1种（phthalazinone pyrazole）;DNA甲基化酶抑制剂1种(Neplanocin A);而在3uM药物浓度下对RBE细胞仍具有强烈抑制作用的有HC Toxin，TSA，SAHA，4-iodo-SAHA及Chaetocin，其中前4种均为HDAC抑制剂。
　　2.对HC Toxin，TSA，SAHA和吉西他滨(Gemcitabine，GEM)进行多种细胞株、多浓度梯度的药效比较，发现HC toxin的抑制作用均较TSA、SAHA、TSA、GEM等强烈，其次是TSA、而GEM最弱。其中，HC toxin对CCLP-1，HuCCT1，TFK-1，RBE的半数有效抑制率，分别为297.6+80.4 nM，520.0+43.0 nM，854.6+86.9 nM,713.7+27.3 nM。
　　实验二:
　　1.细胞计数表明:HC toxin能抑制CCLP-1细胞增殖，并呈现一定的浓度与时间依赖性。平板克隆形成实验表明:经不同浓度HC toxin处理后，细胞克隆形成能力减弱，在HC toxin浓度大于100 nM时与药物浓度呈正相关，50 nM以内差异无统计学意义。
　　2.用光学显微镜观察吉姆萨染色前后的CCLP-1形态变化显示，经HC toxin处理48小时后出现:①细胞密度变小，细胞体积缩小，细胞质成分减少，分裂像减少;②部分细胞变圆脱落，带凋亡小体的细胞明显增多，而细胞胀大破裂者少见;③树突状结构。计算出现凋亡小体的细胞数量，发现HC toxin引起细胞出现凋亡小体与HC toxin浓度呈正相关关系。
　　3.7-AAD染色的流式细胞技术实验显示，与对照组相比实验组经HC toxin处理48小时后，G0/G1期细胞比例明显上升，G2/M期细胞比例明显下降，呈现浓度依赖性，而S期细胞比例变化不具统计学意义。
　　4.AnnexinⅤ FITC联合7-AAD染色的流式细胞技术实验显示，与对照组相比，实验组经HC toxin处理48小时后早期凋亡、晚期凋亡及总凋亡的细胞比例均明显增多，呈现浓度依赖性，差异具有统计学意义。
　　5.Western blot实验表明，经HC toxin处理48小时后，CCLP-1细胞中某些凋亡相关蛋白cytochrome c、bax/bcl-2的相对表达量在各个浓度组的差异无统计学意义，caspase3在HC toxin浓度为400 nM时较对照组有增加，而其他实验组与对照组差异无统计学意义。
　　实验三:
　　1.RT-qPCR检测表明经HC-Toxin处理一段时间后，CCLP-1中Notch1等6个基因转录水平发生了一定的改变。STAT3等10个基因转录水平变化没有统计学意义。
　　2.Immunofluorescence实验和Western blot实验表明，HC toxin处理CCLP-1细胞后，Notch通路被激活，Notch通路相关蛋白Notch1、Hes1表达量明显增加，并呈现浓度相关性。
　　3.CCK-8细胞活力检测试验显示，Notch通道阻滞剂DAPT浓度低于50uM时对CCLP-1细胞无明显的抑制作用，但可以明显增强200 nM HC toxin对CCLP-1细胞活力的抑制作用，当DAPT大于50uM时对CCLP-1细胞具有明显的抑制作用，并与HC toxin呈现协同作用.
　　结论:
　　1.多种表观遗传学药物在体外能对ICC细胞RBE具有强烈的抑制作用，其中HDAC抑制剂尤为突出，提示HDAC有可能是抑制RBE细胞增殖的敏感靶位，但证据还不够充分。
　　2.HC toxin对多种ICC细胞具有强烈的抑制作用，效果比其他HDAC抑制剂和吉西他滨强烈，并呈现一定的浓度与时间依赖性。其对ICC细胞的作用是综合的，多方面的，与抑制细胞增殖，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡有一定关系。
　　3.HC toxin对CCLP-1细胞活力既有抑制作用也有促进作用，抑制作用大于促进作用，促进作用可能与HC toxin激活Notch信号通路有关，可通过联合Notch通路阻滞剂抵消HC toxin对CCLP-1的促进作用。

目录

摘要

实验一 抑制肝内胆管癌细胞增殖的表观遗传学药物筛选

前言

1．目的

2．材料

2．1 实验材料

2．2 主要试剂配制方法

3．方法

3．1 细胞培养、传代、计数及分板、冻存及复苏

3．2 药物处理及CCK-8法检测RBE细胞活性

4．统计学分析

5．实验结果

5．1 关于RBE细胞敏感的表观遗传学药物的初步筛选结果

5．2 基于5．1结果的多细胞株、多浓度的药物作用效果比较

6．讨论

参考文献

实验二 HDAC抑制剂HC toxin对CCLP-1细胞生物学功能的影响

前言

1．目的

2．材料

2．1 实验细胞、试剂与耗材

2．2 主要试剂及配制方法

3．方法

3．1 细胞培养、药物处理、计数、传代及分板等

3．2 细胞爬片与形态学观察

3．3 平板克隆形成实验

3．4 7-AAD染色流式细胞术检测细胞周期时相的影响

3．5 Annexin V／7-AAD双染色法流式细胞术检测凋亡的影响

3．6 Western Blot法检测凋亡相关蛋白表达变化

4．统计学分析

5．实验结果

5．1 HC toxin抑制CCLP-1细胞增殖具有一定的浓度、时间依赖性

5．2 HC toxin抑制CCLP-1细胞克隆形成能力具有一定的浓度依赖性

5．3 HC toxin对CCLP-1细胞的形态学影响是多方面的

5．4 HC toxin将CCLP-1细胞周期阻滞于G0／G1期

5．5 HC toxin诱导CCLP-1细胞凋亡具有浓度依赖性

5．6 HC toxin通过多种凋亡途径完成诱导CCLP-1细胞凋亡

6．讨论

参考文献

实验三 HDAC抑制剂HC toxin对CCLP-1细胞Notch信号通路的影响

前言

1．目的

2．材料

2．1 实验材料

2．2 主要试剂配制方法

2．3 主要仪器见附录

3．方法

3．1 细胞培养、传代、计数及分板、冻存及复苏

3．2 药物处理及CCK-8法检测细胞活性

3．3 RT-qPCR相关实验方法

4．统计学分析

5．实验结果

5．1 HC toxin引起CCLP-1细胞的Notch1等基因的转录水平变化

5．2 HC toxin能引起CCLP-1细胞Notch信号通路相关蛋白上调

5．3 HC toxin能引起CCLP-1的HDAC1及组蛋白H4表达变化

5．4 DAPT能强化HC toxin对CCLP-1的抑制作用

6．讨论

参考文献

附录

主要英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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