生长激素长期刺激导致肝脏生长激素不敏感效应的研究

摘要

目的：
　　生长激素在人体最重要的靶器官是肝脏，其在肝脏中主要的信号转导通路是JAK-STAT通路，而STAT5是该信号通路最主要的效应信号因子，本研究将同时从细胞水平与在体水平，检测生长激素长期刺激下肝脏STAT5磷酸化水平的变化，进而探究生长激素长期刺激对肝脏JAK-STAT信号通路的影响。
　　方法：
　　1.细胞实验部分:本课题选择人肝癌细胞系Hep G2，以含10％（体积分数）胎牛血清的DMEM高糖培养基于37℃恒温CO2培养箱中培养。
　　1.1 Hep G2对数生长期细胞均匀传代至12孔细胞培养板的8个孔，以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，待细胞密度增长至90％左右时将培养基换为不含血清的DMEM进行9小时血清饥饿，然后将细胞分为4组:0min rhGH组，10min rhGH组，30min rhGH组与50min rhGH组，每组2孔。按分组情况予各组工作浓度3000ng/ml的重组人生长激素分别刺激50分钟、30分钟、10分钟、0分钟，每组添加刺激时其余各组予等体积无血清DMEM。刺激结束后以RIPA裂解液冰上裂解细胞，提取细胞总蛋白检测p-STAT5水平。
　　1.2 12孔细胞培养板中放置清洁光滑的无菌盖玻片，Hep G2对数生长期细胞均匀传代接种6个孔，控制细胞密度在30％左右，以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，待细胞贴壁牢固后立即将培养基换为不含血清的DMEM进行9小时血清饥饿，然后将细胞分为3组:0min rhGH组，20min rhGH组，60min rhGH组，每组2孔。按分组情况予各组工作浓度3000ng/ml的重组人生长激素分别刺激60分钟、20分钟、0分钟，每组添加刺激时其余各组予等体积无血清DMEM。刺激结束后常温下移出细胞玻片，以4％多聚甲醛固定后检测p-STAT5水平。
　　1.3 Hep G2对数生长期细胞均匀传代至12孔细胞培养板的4个孔，以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，控制细胞牢固贴壁时细胞密度在40-50％左右，之后将培养基换为含2％胎牛血清的DMEM，并将细胞分为生长激素长期刺激组与对照组，每组2孔。GH长期刺激组每日予工作浓度3000ng/ml的重组人生长激素刺激共3天，对照组每日予等体积无血清DMEM，控制末次添加刺激后24小时细胞密度增长至90％左右，之后将培养基换为不含血清的DMEM进行9小时血清饥饿，最后再予每组添加一次单剂量重组人生长激素（工作浓度3000ng/ml）作为阈上刺激，刺激30分钟后将细胞置于冰上以RIPA裂解液裂解，提取细胞总蛋白检测p-STAT5水平。
　　2.动物实验部分:本课题选择6-8周龄的健康BALB/c雄性小鼠12只随机分为生长激素长期刺激组与对照组，每组6只。GH长期刺激组按1ug/g体重/次的剂量予每日1次腹腔注射重组人生长激素，对照组注射等体积生理盐水，共3周。末次注射后16小时于次日上午8:00处死。处死前30分钟每组随机选出3只予腹腔注射1次单剂量重组人生长激素（1ug/g体重），其余6只注射等体积生理盐水。12只小鼠最终分为4组:对照组，GH单剂量刺激组，GH长期刺激组，GH长期+单剂量刺激组。全部刺激完成后，所有小鼠以水合氯醛充分麻醉，迅速摘取小鼠肝脏存于液氮中，之后移至-80℃超低温冰箱保存备用。冰上研磨小鼠肝脏组织，以RIPA裂解液冰上裂解细胞，提取组织蛋白检测p-STAT5水平。实验过程中，确保每日腹腔注射的时间一致，小鼠处死的时间点相同。每次注射两组交叉进行。
　　3.蛋白信号分子的测定
　　3.1 实验1.1与实验1.3中提取的Hep G2细胞总蛋白，及实验2中提取的小鼠肝脏组织蛋白，应用蛋白免疫印迹法(Western Blot，WB)检测p-STAT5水平。
　　3.2 Hep G2细胞爬片，应用细胞免疫荧光法（Immunofluorescence）染色后于荧光显微镜下观察p-STAT5蛋白信号的荧光强度，检测p-STAT5水平。
　　4.统计分析
　　全部实验数据采用WPS Excel2015记录，并使用SPSS20.0进行统计学分析。实验结果以“算术平均值±标准差（arithmetic mean±standard deviation，M±SD）”表示。两组间比较采用两独立样本t检验(Independent Samples T Test)或Satterthwaite近似t检验（满足或不满足方差齐性）。以P值＜0.05为存在显著性差异，有统计学意义。
　　结果：
　　1.体外研究（细胞培养试验）中生长激素长期刺激对Hep G2细胞p-STAT5水平的影响
　　1.1 实验结果显示，50min rhGH组的Hep G2细胞p-STAT5水平（灰度值:0.55±0.18）显著低于10min rhGH组与30min rhGH组的Hep G2细胞(灰度值分别为1.45±0.39，1.49±0.22)，（P值=0.023 vs.10min rhGH组，P值=0.005 vs.30minrhGH组）;而10min rhGH组与30min rhGH组的Hep G2的p-STAT5水平则无显著差异(P值=0.879)。
　　1.2 实验结果显示，60min rhGH组的Hep G2细胞的p-STAT5蛋白信号荧光强度明显弱于20min rhGH组的Hep G2细胞。
　　1.3 实验结果显示，与对照组(灰度值:1.41±0.41)相比，GH长期刺激组Hep G2细胞的p-STAT5水平（灰度值:0.76±0.31）显著下降（P值=0.026）。
　　2.体内研究（动物实验）中生长激素长期刺激对小鼠肝脏p-STAT5水平的影响
　　2.1 实验结果显示，与对照组(灰度值:1.47±0.45)相比，GH长期刺激组的小鼠肝脏p-STAT5水平（灰度值:0.42±0.06）显著降低。（P值=0.016）
　　2.2 实验结果显示，GH长期+单剂量刺激组小鼠肝脏p-STAT5水平(灰度值:2.05±0.33)显著高于GH长期刺激组的小鼠（灰度值:0.17±0.03）。(P值=0.01)
　　2.3 实验结果显示，GH长期+单剂量刺激组小鼠肝脏的p-STAT5水平(灰度值:1.29±0.34)显著低于GH单剂量刺激组(灰度值:3.48±0.88)。(P值=0.036)
　　结论：
　　1.在细胞培养水平，生长激素长期刺激可抑制STAT5磷酸化，抑制JAK-STAT信号通路。
　　2.在健康小鼠模型中，生长激素长期刺激可抑制STAT5磷酸化，抑制JAK-STAT信号通路，并可致小鼠肝脏对生长激素的敏感性降低。
　　3.结合本研究前期实验结果推论，长期的生长激素刺激可能导致肝脏SOCS-3基因转录水平增高，并由此抑制了STAT5的磷酸化水平，从而抑制了JAK-STAT信号通路，降低肝脏对生长激素刺激的敏感性。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

一、细胞实验部分

1．实验细胞株

2．主要实验试剂

3．实验中使用的抗体

4．主要溶液的配制

5．主要仪器、设备和器材

6．分组干预方案

7．提取细胞总蛋白

8．检测样品蛋白浓度

9．Western blot操作步骤

10．免疫荧光染色步骤

11．统计学分析

二、动物实验部分

1．实验动物

2．主要实验试剂

3．试验中使用的抗体

4．主要溶液的配制

5．主要器材、仪器和设备

6．分组干预方案

7．检测样品蛋白浓度

8．Western blot操作步骤

9．统计学分析

第三章 结果

一、细胞实验部分

二、动物实验部分

第四章 讨论

第五章 小结

参考文献

中英文缩略词对照表

在读期间已经发表和将要发表的论文

致谢

声明