ZEB2通过miR-637靶向Akt1及HMGA1促进胶质瘤细胞生长、侵袭及迁移的分子机制

摘要

目的:
　　胶质瘤是中枢神经系统的第一大肿瘤，多年以来的治疗手段都是以扩大切除加合理的放化疗为主。虽然近年来治疗手段不断进步，但是疗效的改善仍旧十分有限。文献报道术后应用替莫唑胺联合放疗的方法，与单独放疗相比患者的中位生存期仅从12.1个月提高到14.6个月，两年生存率从10.4％提高到26.5％。而近几年出现的新型靶向治疗药物，如靶向血管内皮生长因子(VEGF)药物贝伐单抗、抗整合素抑制剂Cilengitide等，对患者的总体预后也无改善。
　　本文的主要内容是着重探讨了ZEB2在胶质瘤中是否能够通过靶向调控miR-637进而介导了细胞的增殖、侵袭和迁移，而miR-637又是如何进一步对胶质瘤细胞的功能进行调节，以及调控的具体分子机制。这为我们理解胶质瘤的快速增殖和高度侵袭提供了一定的理论基础，也为寻找胶质瘤潜在的治疗靶基因提供了一定的帮助。
　　方法:
　　1.ZEB2在胶质瘤细胞中功能和机制的进一步研究
　　(1)设计并构建4个稳定干扰ZEB2慢病毒载体并进行细胞转染，运用荧光定量PCR和Western blot检测转染效率，选取干扰效率最高的片段进行后续实验;
　　(2)运用噻唑蓝比色(MTT)实验、Edu实验检测ZEB2对胶质瘤细胞增殖功能的影响，运用平板克隆实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞克隆形成的能力;
　　(3)运用划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验检测稳定干扰ZEB2可以抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移;
　　(4)采用裸鼠皮下成瘤实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞的增殖;
　　(5)Western Blot检测干扰ZEB2后细胞中增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化;
　　2.ZEB2通过抑制miR-637转录进而促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移
　　(1)采用miRNAs芯片检测干扰ZEB2表达的U251细胞中表达变化的miRNA，并用荧光定量PCR验证和寻找最有意义的miRNA进行后续研究;生物信息学分析ZEB2可以结合miR-637的启动子区域序列;
　　(2)双荧光素酶报告基因检测ZEB2与miR-637启动子的结合并能抑制其转录;凝胶电泳迁移率实验检测体外条件下ZEB2是否能直接结合miR-637启动子区域;利用染色质免疫共沉淀技术在体内条件下进一步验证ZEB2与miR-637启动子区域的结合。
　　结果:
　　1.ZEB2在胶质瘤中促进细胞的增殖、侵袭和迁移
　　对4个ZEB2的干扰慢病毒载体进行筛选，结果显示U251中shZEB2的A片段干扰效率最高(19.4％)，U87中C片段干扰效率最高(25.0％)，故后续实验U251细胞采用A片段、U87采用C片段进行。
　　随后运用噻唑蓝比色(MTT)实验、Edu实验和裸鼠皮下成瘤实验检测ZEB2对胶质瘤细胞增殖功能的影响，平板克隆实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞克隆形成的能力。MTT实验结果显示，与对照Mock组相比，shZEB2细胞组的存活能力随时间推移而减弱（P＜0.001）;Edu实验显示干扰ZEB2表达后处于S期的细胞百分比显著降低（P均为0.001）;裸鼠皮下成瘤实验结果表明干扰U87细胞中ZEB2的表达后肿瘤体积和重量较对照组明显减小(P＜0.001);平板克隆实验结果表明干扰ZEB2表达后形成克隆数目明显减少（P均为0.001）。即ZEB2在胶质瘤中促进细胞的增殖和克隆形成能力。
　　进一步运用划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验检测ZEB2对胶质瘤细胞的侵袭和迁移的作用。划痕实验结果表明，shZEB2细胞组的划痕间隙随时间延长而减小(P＜0.001);Transwell和Boyden实验结果显示，与对照组相比，U251和U87干扰组的穿膜细胞数显著减少（P=0.001和0.003，P=0.002和0.001）。即ZEB2可以促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。
　　采用Western blot检测了下调胶质瘤细胞U251和U87中的ZEB2蛋白表达后，与细胞增殖、侵袭和迁移相关蛋白的变化情况。结果显示，干扰U251和U87中ZEB2的表达后，PI3K/Akt通路中的p-PI3K、Akt、p-Akt发生下调，与增殖相关的CCND1下调而p21上调，与侵袭和迁移相关的Vimentin、β-catenin、N-Cadherin下调。而其它蛋白如HMGA1、E2F1、PTEN、Bcl-2、NF-kappaB、Sox2等均有不同程度的上调和下调。
　　2.ZEB2通过抑制miR-637转录进而促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移
　　对干扰ZEB2表达的U251细胞进行了CombiMatrix人类miRNAs芯片检测一共发现到了80多个差异表达miRNAs，其中上调的miRNAs有40多个，下调基因miRNAs有30多个。在差异表达miRNAs中，选取其中表达差异最明显且上调的miR-637并采用荧光定量PCR验证。结果显示，干扰ZEB2的表达后，miR-637的表达显著上调（P=0.02和P=0.005）。随后的双荧光素酶报告基因结果表明，干扰ZEB2可以减少其与miR-637启动子的结合(P=0.002)，上调ZEB2可以加强其与miR-637启动子的结合(P=0.004)。凝胶电泳迁移率实验(ElectrophoreticMobility Shift Assay，EMSA)结果显示过表达ZEB2促进其与miR-637启动子的结合。染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）结果表明ZEB2作为转录因子可以直接结合miR-637启动子区域的0-300bp位点。
　　构建稳定过表达miR-637慢病毒载体并转染细胞，荧光定量PCR验证表明miR-637在细胞中被稳定过表达超过400倍和350倍（P均小于0.001）。随后进行细胞功能实验。MTT结果显示较对照组相比，过表达miR-637的细胞存活能力随时间推移而减弱（P＜0.001）;Edu实验结果表明过表达miR-637后U251和U87细胞较对照组的S期细胞明显减少(P＜0.05);平板克隆形成实验表明在胶质瘤细胞U251和U87中上调miR-637的表达可以显著抑制细胞克隆形成的能力(P＜0.05);皮下成瘤实验表明过表达组肿瘤的体积和重量较对照组明显较小（1.36±0.32g vs.2.06±0.45g，P＜0.05），且Ki-67表达阳性率明显较对照组高(P=0.002);Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验结果均表明，过表达miR-637后抑制U251和U87的穿膜，而在过表达miR-637的细胞中加入miR-637抑制剂后穿膜细胞数显著回升（P均小于0.05）。以上结果说明miR-637在胶质瘤中促进细胞的增殖、侵袭和迁移。
　　进一步在稳定过表达ZEB2(ZEB2OE)的细胞中瞬时转染miR-637 mimics后采用MTT、Edu、Transwell、Boyden和划痕实验来检测细胞功能的变化。MTT的实验结果显示与对照ZEB2OE组相比，ZEB2OE+miR-637 OE细胞组的存活能力随时间推移而减弱（P＜0.001）;而Edu实验表明在ZEB2过表达的细胞中上调miR-637后，U251和U87处于S期细胞明显减少（P＜0.05）;Transwell小室体外迁移实验和Boyden小室体外侵袭实验的结果说明在过表达ZEB2的U251和U87中过表达miR-637后，U251和U87的穿膜细胞数明显减少（P均小于0.05）。即说明miR-637对ZEB2促细胞增殖、侵袭和迁移的能力有拮抗作用。
　　结论:
　　ZEB2作为转录因子可以与miR-637上游启动子区域的位点结合并抑制其转录，进而减少miR-637与Akt1和HMGA1的3'-UTR区域靶向结合，从而分别通过上调Cyclin D1和p-Foxo1并下调Foxo1，以及上调Cyclin D1并抑制p15来促进细胞周期的进展。同时，又分别通过上调p-Akt1、β-catenin以及上调β-catenin、NF-kappaB和Vimentin的表达来促进细胞的侵袭和迁移。最后，ZEB2、Akt1和HMGA1在胶质瘤临床样本中高表达，且与WHO分级呈正相关;而miR-637在胶质瘤临床样本中低表达且与WHO分级呈负相关。同时，ZEB2与miR-637的表达以及miR-637与Akt1、HMGA1的表达相互之间均呈负相关。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 ZEB2在胶质瘤细胞中功能和机制的进一步研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二章 ZEB2通过抑制miR-637转录进而促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三章 MiR-637直接靶向调节Akt1及HMGA1进而影响胶质瘤细胞的功能

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第四章 MiR-637靶向Akt1和HMGA1进而调节胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第五章 ZEB2-miR-637-Akt1／HMGA1信号通路在临床组织标本中的表达和分析

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文小结

英文缩写词简表

学习期间发表的论文

致谢

声明