小鼠足细胞特异敲除核因子-κB受体活化因子对蛋白尿的影响

摘要

目的：
　　RANK在足细胞损伤中的意义。
　　损伤足细胞中RANK的信号途径。
　　方法：
　　一、足细胞特异RANK基因敲除小鼠鉴定及表型观察。
　　（一）RABK小鼠的培育及鉴定
　　B6.Cg-Tg(NPHS2-cre)295Lbh/J小鼠购自美国Jackson实验室，RANK-loxP鼠由澳大利亚University of Western Australia的郑铭豪教授提供，在南京大学-南京生物医药研究院饲养及繁殖。饲养与中山大学北校区动物实验中心的无特定病原菌(SPF)环境中，12小时光照/黑暗交替，自由进食、饮水。留小鼠尾巴提取DNA后进行基因型鉴定。普通C57小鼠购于中山大学东校区动物实验中心，饲养于中山大学北校区动物实验中心的无特定病原菌(SPF)环境中，12小时光照/黑暗交替，自由进食、饮水。选择不同基因型的雌性小鼠各6只，年龄为6-8周，体重为20-30g，进行表型观察，内容包括:体重和肾脏形态。
　　二、建立脂多糖(LPS)诱导的小鼠短暂蛋白尿模型，观察三组小鼠肾脏组织病理，足突融合及对Integrin-β1、integrin-β3、uPAR表达的影响。
　　（一）动物分组及脂多糖(LPS)诱导的小鼠短暂蛋白尿模型的建立
　　随机选取年龄为6-8周的雌性小鼠经基因鉴定为RANK足细胞特异敲除鼠（RANK-/-），野生型对照组(WT)小鼠及普通C57小鼠各6只，体重为20-30g。分为C57组（普通C57小鼠），W组（野生型对照组小鼠）及KO组（足细胞特异性RANK-/-小鼠）。在LPS前分别收集18只小鼠的24h尿液，检测尿量及白蛋白肌酐比。之后给予100μg/只腹腔注射LPS，于24h后收集24h尿液测量尿量及白蛋白肌酐比。所有小鼠饲养于代谢笼中，自由进食和饮水。
　　（二）标本取材及处理
　　分别在给药前及给药后第二天收集24h尿液，分别处死三组动物。留取肾皮质，一部分于液氮罐中长期保存，另一部分用于病理检查并制作冰冻切片用于后期免疫荧光实验，电镜检查以及提取蛋白做westernblot实验。
　　（三）各指标的检测与观察
　　1、LPS造模后尿白蛋白肌酐比测定:小鼠腹腔注射LPS后收集24h尿液。按照试剂盒要求，用ELISA法测定尿液中白蛋白及肌酐的含量，计算尿白蛋白肌酐比值。
　　2、病理:LPS前后三组小鼠均取肾组织制成石蜡切片行PAS染色，观察LPS前后三组肾小球和肾小管损伤程度。WT1可作为足细胞胞核的特异性标记用来计数足细胞。免疫组化:兔抗大鼠WT1(SC-192)购自美国Santa Cruz公司，SP法按试剂盒说明书操作。实验结果应用病理图像分析软件做半定量分析，每个切片随机选取10个肾小球（400倍），对于WT1染色的切片，在电脑保存400倍图像的同时，计数染色阳性的足细胞个数。
　　3、电镜:小鼠腹腔注射LPS后收集完24h尿液，第二天处死。取新鲜肾脏皮质标本1-2mm3，立即送冰冻切片。美国FEI透射电镜(Tecnai G2 SpiritTwin):观察肾小球基底膜厚度，足细胞形态。每只小鼠选择1-2个肾小球，对每个肾小球随机选取10-20个不同位置进行测定。
　　4、免疫荧光及激光共聚焦:1）.临用前拿出切片，室温充分晾干，切忌干片;2）.用1×PBS洗3次×5分钟/每次;3）.吸取0.5％TritonⅩ-100置于组织上，透化20分钟;4）.用1×PBS洗3次×5分钟/每次;5）.滴加5％BSA置于室温下封闭10分钟;6）.加一抗在湿盒里，4℃过夜;7).1×PBS洗3次，每次5分钟;8）.再于组织上滴加第二种一抗（须与第一种一抗种属不同）;9）.滴加荧光二抗（用1％BSA稀释）置于室温37℃，反应60分钟，注意避光;10）.用1×PBS洗3次×5分钟/每次;11）.如需做双重免疫荧光，再滴加第二种二抗于37℃，反应60分钟;12）.用1×PBS洗3次×5分钟/每次;13）.抗荧光衰减剂封片;14）.湿盒避光放入4℃冰箱待观察;15）.共聚焦显微镜观察。
　　结果：
　　一、足细胞特异RANK基因敲除小鼠的体质量，肾脏形态、重量与野生型对照组(WT)小鼠及普通C57小鼠差异无统计学意义。
　　将RANK-loxP鼠与NPHS2启动Cre的转基因鼠B6.Cg-Tg(NPHS2-cre)295Lbh/J交配，筛选出同时含有Cre及RANK两种基因型的子代小鼠，其足细胞将缺失RANK基因表达。在小鼠成年期（6-8周时），对6只雌性的RANK-/-小鼠与WT小鼠及普通C57小鼠进行比较。C57组小鼠体重（25.47±6.03）vs W组小鼠体重（22.45±2.38）vs KO组小鼠体重(23.72±5.41)差异无统计学意义。C57组小鼠肾脏重量(1.27±0.05) vs W组小鼠肾脏重量（1.12±0.11）vs KO组小鼠肾脏重量（1.15±0.10）差异无统计学意义。
　　二、注射脂多糖(LPS)后，足细胞特异RANK基因敲除小鼠（KO组）蛋白尿较野生型对照组(WT)小鼠及普通C57小鼠有所减少。
　　实验前，三组小鼠尿白蛋白肌酐比分别为C57组（6.34±0.68）vs W组（7.39±1.84）vs KO组（7.40±1.60），差异无统计学意义。注射LPS后24h，三组小鼠尿白蛋白肌酐比(μg/mg)开始显著升高，提示造模成功。同时KO组（23.70±9.90）明显低于野生型对照组（107.56±22.32）及普通C57小鼠组(132.13±14.26),(P＜0.05)。
　　三、注射脂多糖(LPS)后，三组小鼠肾脏组织病理结果无明显改变，三组小鼠足细胞数目均有所下降，但KO组足细胞数目较其余两对照组下降得更少。
　　四、电镜下足细胞特异RANK基因敲除小鼠的足细胞足突融合较野生型对照组(WT)小鼠及普通C57小鼠有所减少。
　　实验前，各组小鼠肾脏组织在电镜下观察形态正常，足细胞无病变。注射LPS后24h，可以观察到三组小鼠足细胞足突出现融合。但在C57组及W组，足细胞足突融合范围更广泛，而KO组足细胞足突融合情况明显较对照组减轻。
　　五、脂多糖(LPS)诱导的小鼠短暂蛋白尿模型中，三组小鼠肾脏组织中Integrin-β1、imegrin-β3、uPAR表达的影响。
　　（一）使用激光共聚焦显微镜观察双重免疫荧光染色的小鼠肾脏组织
　　Synaptopodin（绿色荧光）是足细胞特异性骨架蛋白，可以用来定位足细胞。在注射LPS前，三组小鼠Synaptopodin表达无差异。已知在正常小鼠肾小球上，RANK（红色荧光）是微量表达于足细胞的。在本实验结果中，注射LPS前，C57组及W组RANK均微量表达，但KO组无RANK表达。在注射LPS后，三组小鼠Synaptopodin表达均有所下降，且C57组及W组RANK表达量明显上升，但KO组依旧无RANK表达。提示KO组的确为足细胞特异性RANK敲除鼠。
　　脂多糖(LPS)诱导的小鼠短暂蛋白尿模型中，三组小鼠肾脏组织中integrin-β1表达的影响。
　　在本实验结果中，注射LPS前三组小鼠integrin-β1（红色荧光）在肾小球上表达无明显差异，与Synaptopodin（绿色荧光）共定位。而注射LPS后，三组小鼠integrin-β1的表达均有所下降，但KO组小鼠相对其他两组小鼠integrin-β1表达的下降有所增加。
　　（二）使用Westernblot检测三组小鼠肾脏组织中integrin-β1、integrin-β3、uPAR表达的影响。
　　脂多糖(LPS)诱导的小鼠短暂蛋白尿模型中，三组小鼠肾脏组织中integrin-β1表达的影响。
　　Western方法检测发现LPS后三组小鼠肾脏组织的Integrin-β1表达均有所下降，但KO组相对于C57组及W组，Integrin-β1的表达下降的更多。
　　脂多糖(LPS)诱导的小鼠短暂蛋白尿模型中，三组小鼠肾脏组织中integrin-β3表达的影响。
　　Western方法检测发现LPS后三组小鼠肾脏组织的Integrin-β3表达均有所上升，但KO组相对于C57组及W组，Integrin-β3的表达上升的更少。
　　结论：
　　一、足细胞特异RANK基因敲除小鼠的体质量，肾脏形态、重量及蛋白尿水平与野生型对照组(WT)小鼠及普通C57小鼠差异无统计学意义。
　　二、在脂多糖(LPS)诱导的小鼠短暂蛋白尿模型中，足细胞特异RANK基因敲除小鼠的蛋白尿水平较其余两对照组有明显减少，提示RANK在足细胞损伤中具有重要价值。
　　三、在脂多糖诱导的小鼠短暂蛋白尿模型中，三组小鼠肾脏组织病理结果无明显改变，三组小鼠足细胞数目均有所下降，但KO组足细胞数目较其余两对照组下降得更少，且电镜下KO组足突融合较其余两对照组有所减少，提示足细胞特异性敲除RANK基因对足细胞具有保护意义。
　　四、在脂多糖(LPS)诱导的小鼠短暂蛋白尿模型中，KO组小鼠的integrin-β1表达较其余两对照组小鼠下降的更多，integrin-β3表达较其余两对照组小鼠上升的更少，uPAR的表达较其余两对照组小鼠上升的更少，提示在足细胞中RANK基因可能通过与integrin-β1，uPAR及integrin-β3等分子相互作用，从而介导足细胞的损伤，影响蛋白尿的发生。

目录

摘要

引言

材料与方法

1．实验材料

2．主要试剂

3．主要仪器

4．足细胞特异RANK基因敲除鼠的培育及鉴定

5．脂多糖诱导的短暂蛋白尿小鼠动物模型的建立

6．尿蛋白的测定

7．肾脏病理分析及足细胞计数

8．电镜下足细胞足突融合的观察

9．免疫荧光及激光共聚焦

10．蛋白免疫印迹

11．统计学处理

结果

一、足细胞特异RANK基因敲除小鼠的体质量，肾脏形态、重量与野生型对照组(WT)小鼠及普通C57小鼠差异无统计学意义

二、注射脂多糖(LPS)后，足细胞特异RANK基因敲除小鼠(Ko组)蛋白尿较野生型对照组(WT)小鼠及普通C57小鼠有所减少

三、注射脂多糖(LPS)后，三组小鼠肾脏组织病理结果无明显改变，三组小鼠足细胞数目均有所下降，但KO组足细胞数目较其余两对照组下降得更少

四、电镜下足细胞特异RANK基因敲除小鼠的足细胞足突融合较野生型对照组(WT)小鼠及普通C57小鼠有所减少

五、脂多糖(LPS)诱导的小鼠短暂蛋白尿模型中，三组小鼠肾脏组织中RANK、Integrin-β1、integrin-β3表达的影响

讨论

结论

参考文献

中英文词表

在读硕士期间的成果

致谢

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