小鼠核因子κB受体活化因子配基(mRANKL)活性区的克隆、表达及生物活性分析

摘要

核因子kB受体活化因子配基(RANKL)是诱导破骨细胞分化，成熟的重要因子，在生物学及医学研究中具有广泛的应用。RANKL主要结合到破骨前体细胞的核因子kB活化因子受体(RANK)上，启动下游NF-kB，P38，ERK，JNK等信号通路，刺激破骨细胞的分化，成熟及成熟后的破骨细胞存活。由于RANKL在破骨细胞的发育过程中发挥重要作用，所以它的失调可引发多种骨骼疾病，如骨质疏松，风湿性关节炎等疾病。现在开发了多种针对RANKL及它所调控的信号通路的药物，用于治疗RANKL所引发的骨骼疾病。因此建立制取高纯度的鼠源RANKL(mRANKL)重组蛋白，并诱导破骨细胞前体向破骨细胞分化这个模型具有重要的现实意义。它不仅可以为治疗骨骼疾病的筛药实验提供模型，而且可以极大的降低实验室成本。
　　 在本实验中，以鼠的骨髓细胞cDNA为模板，利用PCR技术体外扩增小鼠核因子kB受体活化因子配基(mRANKL)活性区eDNA，将PCR产物克隆至His标签的融合蛋白表达载体pET28a(+)，鉴定正确的质粒转化至BL21表达菌中。通过不同温度、IPTG浓度及诱导时间诱导目的蛋白表达，筛选出mRANKL融合蛋白表达的最佳条件。以最佳条件大量纯化mRANKL重组蛋白，纯化后的蛋白过滤并稀释成不同浓度，与商业购买的mRANKL蛋白同时分别刺激小鼠单核/巨噬细胞Raw264.7细胞分化，可以看见有明显的破骨细胞形成，表明mRANKL重组蛋白具有生物活性，可替代商业产的鼠源RANKL。