子宫内膜巨噬细胞对血管内皮生长因子A的表达及胚胎着床的影响

摘要

深入研究围着床期子宫内膜血管生成微环境的调节机制，有助于进一步理解子宫内膜容受性的内涵，为探索干预子宫内膜容受性调节的新靶点提供更充分的科学依据，并能为推动着床障碍（反复体外受精-胚胎移植失败和习惯性流产）、不明原因性不孕的促血管生成治疗奠定实验基础，同时也为异常子宫出血、免疫避孕、器官移植研究提供新的思路，对于改善女性生殖能力及治疗不孕不育和复发性流产等相关疾病具有重要意义。
　　目的：
　　建立子宫内膜局部抑制巨噬细胞的小鼠模型，观察着床期巨噬细胞抑制对胚胎着床影响，研究小鼠子宫内膜巨噬细胞对VEGFA、iNOS表达的影响，并研究子宫内膜着床位点与非着床位点巨噬细胞、VEGFA、iNOS的分布差异，进一步探讨其在胚胎着床中的作用。
　　方法：
　　1)取成熟未育的昆明种小鼠为研究对象，阴道涂片观察细胞组织学变化，确定动情期小鼠。取动情期小鼠30只，随机分为两种注射途径给药，尾静脉注射(n=15)和宫腔内注射(n=15)。小鼠随机分为三组，实验组(n=5)，对照组(n=5)和空白组(n=5)。尾静脉组中，实验组从尾静脉缓慢推注包裹有氯膦酸二钠的脂质体混悬液0.1ml/10g，对照组包裹有磷酸缓冲盐的脂质体(PBSliposomes，PL)，空白组则注射灭菌PBS。宫腔内注射中，分别用微量注射器，手术直视下由卵巢侧宫角向宫腔内注射包裹有氯膦酸二钠的脂质体混悬液、包裹有PBS脂质体和灭菌PBS各15ul。
　　2)于注射后48h，采用免疫组织化学法、流式细胞学方法检测射氯膦酸二钠脂质体对子宫F4/80+巨噬细胞的抑制效率。择优选取宫腔内注射建立小鼠着床期子宫内膜巨噬细胞抑制模型。
　　3)取D3.5（雌鼠交配后次日晨阴道见栓为D0.5）孕鼠30只，随机分为三组，实验组(n=10)、对照组(n=10)和空白组(n=10)。使用微量注射器从近卵巢侧子宫角部向宫腔内缓慢注入15ul药物。实验组向左侧宫腔内注射CL，右侧注射包裹有PBS脂质体;对照组向双侧宫腔内注射PL;空白组向双侧宫腔内注射等体积灭菌PBS溶液作为空白对照。
　　4)获取D5.5小鼠子宫和卵巢，台盼兰染色显示各单侧子宫的胚胎着床数，HE染色观察着床点组织形态变化。
　　5)采用免疫组化技术检测子宫内膜、卵巢内巨噬细胞数量变化。流式细胞学方法检测子宫F4/80+CD11b+巨噬细胞相对百分比，验证注射CL对着床期子宫巨噬细胞的选择性抑制作用。
　　6)免疫组织化学方法观察着床位点和非着床位点巨噬细胞、VEGFA、iNOS的表达变化。
　　结果：
　　1)宫腔内注射后，HE染色显示小鼠子宫组织完整，腺体结构清晰，无炎性细胞浸润。
　　2)在对动情期小鼠进行尾静脉注射、宫腔内注射后48h，免疫组织化学方法检测实验组的子宫内膜巨噬细胞数量与对照组(P＜0.01)、空白组(P＜0.01)相比均显著减少。两种方法在子宫内膜巨噬细胞的抑制程度无明显差异(P=0.788)。
　　3)宫腔内注射后48h，实验组的卵巢巨噬细胞数量与对照组、空白组相比无明显差异(P=0.762)。采用尾静脉途径注射脂质体后，对照组、空白组与宫腔内注射结果相似，但实验组卵巢内巨噬细胞却有所下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。尾静脉注射相比宫腔内注射对卵巢巨噬细胞有明显抑制作用(P＜0.05)。
　　4)流式细胞学检测动情期小鼠尾静脉注射、宫腔内注射后48h，实验组F4/80+巨噬细胞较对照组及空白组均显著下降，差异有统计学意义。
　　5)着床期宫腔内注射CL后，免疫组织化学检测方法检测到着床位点上，实验组左侧注射CL的子宫内膜巨噬细胞数（22.50±8.15）较PL侧（83.60±12.15）显著降低，较对照组左侧和空白组左侧也显著降低(P＜0.05)，三组的右侧则无明显差异。非着床位点巨噬细胞数变化与之类似。着床位点的巨噬细胞均高于非着床位点，巨噬细胞具有聚集于着床位点的趋势。
　　6)实验组左侧子宫宫腔内注射CL后48h，对小鼠子宫单细胞悬液用流式细胞学方法检测F4/80+CD11b+巨噬细胞相对比例较实验组注射PL侧、对照组和空白组的各侧有显著下降，抑制率为74％。
　　7)着床期宫腔内注射CL后，实验组卵巢的巨噬细胞数量与对照组、空白组相比无明显差异。
　　8)当抑制了着床期间子宫局部的巨噬细胞后，胚胎着床数显著降低，胚胎着床被部分抑制。实验组左侧注射CL后平均胚胎着床数为2.20±1.81个，显著低于实验组右侧注射PL、空白组左侧及对照组左侧，平均着床位点分别:5.10±1.91个，5.00±2.21，5.80±2.25(P＜0.05)，三组右侧无明显差异。
　　9)在实验组注射CL侧仅有的胚胎着床位点，虽可见胚胎结构，但宫腔未闭合，蜕膜化范围较实验组PL侧缩小。PL侧小鼠着床位点上皮细胞明显水肿，间质细胞明显蜕膜化，宫腔闭合。
　　10)在着床位点，随着实验组注射CL侧的子宫巨噬细胞受到抑制，子宫内膜的VEGFA蛋白表达明显低于实验组右侧注射PL(P＜0.05)，非着床点实验组注射CL侧的子宫VEGFA的表达较PL侧虽有所降低，但差异无统计学意义(P=0.069)，实验组两侧的VEGFA表达在着床位点的均高于非着床位点(P＜0.05)。
　　11)实验组注射CL侧和PL侧子宫内膜的iNOS阳性细胞数量无明显差异(P=0.552)。非着床点iNOS的表达在CL侧与PL侧之间无明显差异(p=0.711)。实验组PL侧子宫iNOS阳性细胞数在着床位点的高于非着床位点，差异有统计学意义(P＜0.05)。而CL侧iNOS阳性细胞数在着床位点虽高于非着床位点，但差异无统计学意义(P=0.118)。
　　结论：
　　1)严格遵守无菌操作的宫腔内注射并不影响子宫组织完整性，可作为宫腔内给药的途径。
　　2)利用巨噬细胞特异性清除剂氯膦酸二钠脂质体，通过两种途径:尾静脉注射与宫腔内注射，均能有效抑制小鼠子宫巨噬细胞，而通过宫腔内注射可有效避免对卵巢的影响，且单侧的药物给药可以使得两侧的子宫互为对照，为精确研究子宫内膜巨噬细胞的功能提供良好的动物模型，在国内外为首次报道。
　　3)抑制子宫局部巨噬细胞导致胚胎着床率下降，着床部位蜕膜化不完全，宫腔不能闭合，证明子宫内膜中的巨噬细胞为胚胎着床所必需。
　　4)当着床期抑制子宫内膜巨噬细胞后，着床点VEGFA的表达随巨噬细胞的抑制一致性降低，提示巨噬细胞可能是通过调控VEGFA的表达，参与构建蜕膜局部血管生成微环境，从而影响子宫内膜容受性及胚胎着床。
　　5)子宫的iNOS表达并不随子宫巨噬细胞的抑制而降低，可能其表达并不完全受巨噬细胞影响，存在其他途径代替调控。
　　6)巨噬细胞、VEGFA、iNOS在着床点的表达高于非着床点，其差异进一步说明巨噬细胞、VEGFA、iNOS不仅与胚胎着床相关，也可能参与了着床点的选择，其具体机制还需要进一步研究。

目录

摘要

前言

第一章 建立子宫局部的巨噬细胞抑制模型

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 抑制着床期子宫局部巨噬细胞对着床率的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 结论

第三章 着床期子宫巨噬细胞抑制后VEGFA的表达变化

第一节 着床期子宫巨噬细胞抑制后VEGFA的表达变化

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二节 着床期子宫巨噬细胞抑制后iNOS的表达交化

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 结论

全文小结

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

中英文缩略词表

致谢

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