电针对JNK基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤脑内ERK、p38信号通路的影响

摘要

目的：
　　脑缺血损伤具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，已成为影响人类健康的疾病之一。电针对脑缺血再灌注损伤的MAPK家族信号通路调控已有相关研究证明。而对于MAPK家族信号通路的整体调控作用研究较少，本研究试图以JNK基因敲除小鼠为研究对象，从MAPK家族信号通路的整体性出发研究电针对JNK基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制。为临床电针治疗脑缺血卒中进一步提供科学基础依据。
　　方法：
　　用随机数字法将54只JNK基因敲除小鼠随机分为假手术组，模型组，电针组，每组又分为2h，1d，3d3个亚组，参照Longa法制作局灶性脑缺血模型。电针组选用“尺泽、合谷”，“足三里、三阴交”穴位组合进行电针干预，每天1次。采用神经行为学对大鼠神经功能症状进行评分、免疫双标结合激光共聚集显微镜，免疫印迹检测JNK基因敲除小鼠脑内p-ERK、p-p38的表达以及Q-PCR检测ERK、p38mRNA表达水平。
　　结果：
　　1.神经功能缺损症状：在JNK基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤在3d时间点上，电针与模型组比较能降低JNK基因敲除小鼠神经缺陷评分(p＜0.05)，有统计学意义。
　　2.大脑海马和皮层区p-ERK和p-p38光密度值的表达情况：电针对JNK基因敲除小鼠海马和皮层区p-ERK和p-p38的光密度表达趋势大致相同。在脑缺血再灌注1d和3d的时间点中，电针组p-ERK的IOD表达高于模型组的表达，即与模型组相比能上调p-ERK信号通路的表达(p＜0.05);相同再灌注的时间段中电针与I/R组比较，电针组中p-p38的IOD值比模型组低，即电针下调p-p38信号通路的表达较模型组好，具有统计学差异(p＜0.05)。
　　3.ERK，p38mRNA基因相对表达量：1d，3d时间点上，与I/R组相比，EA组可以提高ERK的mRNA表达，同时降低p38的mRNA表达（均为p＜0.05）。
　　4.p-ERK，p-p38蛋白相对表达量：电针组JNK基因敲除小鼠脑内p-ERK相对蛋白含量较模型组表达高，而p-p38相对蛋白含量较模型组相应蛋白表达低(p＜0.05)。
　　结论：
　　电针“合谷、尺泽穴”，“三阴交、足三里”穴位组合可减轻JNK基因敲除脑缺血再灌注损伤神经功能缺损症状，减轻脑组织损伤，起到脑保护作用。其脑保护作用的机制可能与电针同时上调JNK基因敲除小鼠脑内p-ERK，下调p-p38信号通路的表达有关。“电针干预—同步调控JNK基因敲除小鼠脑内MAPK信号通路ERK，p38信号通路的表达—促进神经功能恢复—抑制脑缺血再灌注损伤”的调控途径可能为电针调控JNK基因敲除脑缺血再灌注的机制之一。

目录

摘要

前言

第一章 文献研究

1．1 中医对缺血性脑卒中的认识

1．1．1 中风病的概述

1．1．2 针灸对中风病的研究

1．2 现代医学对脑缺血再灌注损伤的认识

1．2．1 脑缺血再灌注损伤的概述

1．2．2 针灸对脑缺血再灌注损伤的机制研究

1．3 MAPK家族信号通路的认识

1．3．1 MAPK家族信号通路的概述

1．3．2 MAPK家族信号通路与脑缺血再灌注损伤的关系

1．3．3 针刺对脑缺血再灌注损伤的MAPK家族通路的研究

1．4 激光共聚焦显微镜技术的应用

1．4．1 激光共聚焦显微镜技术的概述

1．4．2 CSLM在针刺对脑缺血再灌注损伤机制研究的应用

1．5 基因敲除技术的应用

1．5．1 基因敲除技术的概述

1．5．2 基因敲除技术动物模型在针刺研究脑缺血再灌注损伤机制研究的应用

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验器材

2．1．3 实验器械

2．1．4 实验主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 实验分组

2．2．2 造模方法

2．2．3 选穴以及干预方法

2．2．4 标本取材

2．3 观察指标与方法

2．3．1 JNK基因敲除小鼠神经功能缺损评分

2．3．3 实时定量PCR(Q-PCR)

2．3．4 免疫印迹试验(WB)

2．4 统计分析

2．5 结果与分析

2．5．1 电针对JNK基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤神经功能缺损评分的影响

2．5．2 电针对JNK基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤脑内海马和皮层区p-ERK和p-p38光密度值的表达情况

2．5．3 电针对JNK基因敲除小鼠脑内ERK，p38mRNA基因相对表达量的影响

2．5．4 电针对JNK基因敲除小鼠p-ERK，p-p38蛋白相对表达量的影响

2．6 讨论

2．6．1 JNK基因敲除小鼠及动物模型的选用分析

2．6．2 免疫荧光双标结合CLSM技术以及Q-PCR／WB技术方法的优势

2．6．3 电针改善脑缺血再灌注损伤神经功能缺损症状

2．6．4 电针提高JNK基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤脑内ERK MAPK信号通路的表达

2．6．5 电针降低JNK基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤脑内p38 MAPK信号通路的表达

2．6．6 电针同时调控JNK基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤脑内ERK，p38 MAPK信号通路表达

2．6．7 电针调控JNK基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤脑内ERK，p38 MAPK信号通路的时间点选择

2．6．8 表里经配穴法治疗脑中风的机理可能是通过启动MAPK复合信号调控抑制脑缺血再灌注损伤

2．6．9 实验研究的思考和总结

第三章 小结

3．1 结论

3．2 本研究创新点

3．3 不足及展望

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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