裂-a-五环三萜衍生物的合成及其体外抗HBV活性研究

摘要

慢性乙型肝炎是乙肝病毒（HBV）在宿主中不断增殖而引起的长期的进展性疾病，部分病程可迁延转为重型肝炎、肝硬化甚至肝癌。目前的治疗药物存在应答率低、副作用大、易产生耐药抗性以及停药后反弹等不足。中医药在病毒性疾病的治疗中具有明显优势，也是获得先导化合物的重要来源。本论文基于前期研究，对具有抗病毒、保肝护肝作用的中药有效成分进行结构修饰，为寻找发现高效低毒的抗HBV药物提供依据。
　　1.目的：
　　对具有抗病毒、保肝护肝的中药有效成分五环三萜化合物进行结构修饰，寻找具有抗HBV活性的先导化合物。
　　2.方法：
　　2.1 目标化合物的合成：以齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)、甘草次酸(GA)等五环三萜化合物为原料，采用Jones试剂氧化、Baeyer-Villiger氧化、碱水解等反应，制备裂-A-五环三萜衍生物，通过现代波谱技术手段对得到的各化合物进行结构鉴定。
　　2.2 对HepG2.2.15细胞的毒性：采用噻唑蓝(MTT)比色法，观察各化合物对细胞存活率的影响，并计算半数毒性浓度(CC50)。
　　2.3 对HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用：采用酶联免疫法(ELISA)，观察各化合物对HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响，计算化合物对抗原的半数抑制浓度(IC50);采用流式细胞技术对活性较好的化合物进行验证。
　　2.4 对HBVDNA、HBVcccDNA复制的抑制作用：采用荧光定量PCR法(FQ-PCR)筛选出具有较强抑制HBVDNA复制作用的化合物，再以FQ-PCR法评价筛选出的各化合物对cccDNA复制的抑制作用。
　　上述测得数据均采用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析，判断组间差异是否有统计学意义。
　　3.结果：
　　3.1 合成了七个裂-A-五环三萜-3，4-内酯：OA-2-1BV、OA-2-2BV、OA-Br-1-1、OA-4、GA-2、UA-2和F-1;三个内酯的水解产物OA-3、GA-3和UA-3;其中化合物GA-3、OA-2-2BV、OA-Br-1和OA-Br-1-1为新化合物，各化合物的结构经1H-NMR、13C-NMR、DEPT、IR、MS等现代波谱技术得到确证。
　　3.2 除OA-Br-1(CC50=100.4μM)外，其余各化合物半数毒性浓度CC50值均大于400μM。
　　3.3 合成的裂-A-五环三萜-3，4-内酯对HBsAg、HBeAg两个抗原分泌的抑制作用均比原料有不同程度的提高，而水解产物相对于内酯化合物活性有轻微下降。活性最好的化合物OA-2-2BV和OA-4对HBeAg分泌的抑制作用随浓度增加而增大，ELISA实验测得二者IC50值分别为0.14μM和0.86μM，阳性对照药OA为813.6μM;流失细胞实验测得在25μM时，二者对HBeAg分泌抑制率分别达到33.5％和34.0％。各化合物对HBeAg分泌的抑制效果要优于对HBsAg的抑制。此外，裂-A-齐墩果烷型化合物（OA与GA系列）活性优于熊果烷型(UA系列)。C12/C13碳碳双键对抗原分泌的抑制活性有较大的贡献。
　　3.4 合成的裂-A-五环三萜-3，4-内酯OA-2-1BV、OA-2-2BV、OA-Br-1-1、OA-4、GA-2、UA-2和F-1对HBV DNA复制的抑制效果要优于其起始原料(＜10％)，在25μM时，抑制率分别为51.40％、83.32％、82.36％、46.00％、27.93％和11.49％;各内酯的水解产物UA-3、GA-3和OA-3活性比水解前有所上升，尤其是化合物GA-3，抑制率为91.56％，与阳性药物拉米夫定(92.83％)相当。化合物OA-2-2BV、OA-4和GA-3抑制HBV cccDNA复制的IC50分别为32.7μM、33.5μM和12.3μM，且呈现剂量依赖性，提示化合物GA-3是一个很有潜力的抗HBV先导化合物。在抑制HBV DNA复制方面，同样齐墩果烷型化合物(OA与GA系列)优于熊果烷型（UA系列）。C12/C13碳碳双键对HBV DNA复制的抑制活性有较大的贡献。
　　4.结论：
　　裂-A-五环三萜衍生物能显著提高五环三萜化合物的抗HBV活性，相较于原料OA，化合物OA-2-2BV和OA-4对e抗原的分泌的抑制作用提高约1000倍;化合物GA-3对HBV DNA的抑制率为91.56％，与阳性对照药拉米夫定相当;化合物OA-2-2BV、OA-4和GA-3抑制HBV cccDNA复制的IC50分别为32.7μM、33.5μM和12.3μM，且呈现剂量依赖性。化合物GA-3是一个很有潜力的抗HBV先导化合物。裂-A-齐墩果烷型环化合物(OA与GA系列)抗HBV的活性优于熊果烷型（UA系列）;C12/C13碳碳双键对抗HBV活性可能有较大的贡献。

目录

摘要

1．引言

2．乙型病毒性肝炎的发病机制

3．抗HBV药物的研究进展

4．五环三萜化合物抗乙型病毒性肝炎活性研究

参考文献

第二章 目标化合物的设计与合成

1．目标化合物的设计

2．目标化合物的合成

3．化合物的结构确定

4．讨论

5．小结

6．实验部分

参考文献

1．前言

2．实验部分

3．结果与讨论

4小结

参考文献

全文总结与展望

全文缩略词表

附录

硕士研究生期间的研究成果

致谢

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