熊果酸-3’-取代丙醇酯衍生物的合成及抗肿瘤活性研究

摘要

本发明公开了熊果酸-3’-取代丙醇酯衍生物，其结构式如下：

说明书

技术领域

本发明涉及熊果酸的衍生物、熊果酸衍生物的制备方法及熊果酸衍生物的 用途。是对具有抗肿瘤活性的单体熊果酸进行结构修饰，得到一系列疗效更好 的熊果酸的衍生物。

背景技术

抗肿瘤作为当今时代医学界的一个热门话题，一直吸引着无数的热血学者 去探索、研究。熊果酸(Ursolid Acid，简称UA)即3β-羟基-熊果-12-烯-28- 酸(3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid)，属于五环三萜类天然化合物，是自 然界中分布较广的天然活性化合物，如杜鹃花科植物雄果的叶、果实，玄参科 植物毛泡桐的叶，茜草科植物栀子的果实、龙胆科植物湿生蕾、木樨科植物女 贞的叶，紫威科植物毛子草的地上部分等多种不同科、属植物中、其结构式如 下所示：

研究表明，具有广泛的生物活性，当然，抗肿瘤活性是其最重要的生物活性 之一。熊果酸不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细胞有抑 制生长的作用。目前，绝大多数的抗肿瘤药物都具有不同程度的肝损伤副作用， 肝癌的临床治疗中至今仍未发现既能抗肿瘤又能保护正常肝细胞的药物，而熊 果酸具有保肝、抗肝炎作用，因此熊果酸有望以低毒抗肿瘤药物来弥补这一空 缺。日本科学家早在1990年就提出熊果酸将成为最有希望抗癌的药物之一。近 年来研究发现，熊果酸具有明显的抗突变作用、细胞毒作用、并能诱导肿瘤细 胞凋亡、抗血管形成及诱导肿瘤细胞分化。

Young^[12]等以Ames试验研究熊果酸的抗突变作用，发现熊果酸可以对抗致 癌物质如苯并芘、黄曲霉素B1诱发的基因突变。Ohigashi^[13]等以抗TPA诱导的 Raji细胞EBA-EA活化试验模型来筛选皮肤癌促癌物的抑制剂。沈红梅^[14]等对 乌梅的主要成分熊果酸进行的HL-60体外实验表明，熊果酸具有抑制HL-60细 胞生长的作用。

熊果酸能直接杀伤肿瘤细胞，根据Lee^[15]等用熊果酸进行的多种癌细胞系 的细胞病毒试验的研究结果，发现熊果酸对P-388和L-1210白血病细胞、A-549 人肺癌细胞有显著的细胞毒作用，且LD₅₀均小于4mg/mol；对KB肿瘤细胞、 人结肠癌细胞HCT-8、乳腺癌细胞MCF-7显示边缘细胞毒作用。Kim^[16]等从白 花蛇舌草中提取熊果酸进行实验，结果显示熊果酸对所测的肿瘤细胞有明显的 细胞毒作用；且熊果酸对T淋巴细胞瘤Jurkat具有明显的抗肿瘤活性。Li^[17]等用 熊果酸对人结肠癌HCT-15细胞株进行实验，在48h和60h发现细胞数明显减少。

细胞凋亡(Apoptosis)是受基因调控的一种主动性细胞自杀过程，他与肿 瘤的发生、发展和消退关系密切，具有独特的生化和形态特征。Baek^[18]等研究 表明熊果酸能明显抑制人白血病细胞HL-60的增殖，诱导HL-60细胞凋亡。黄 炜^[19]等的研究表明，熊果酸可以降低PGCL3细胞增殖能力。Kim^[16]等对经熊果 酸处理过的SNU-1细胞进行形态学观察，并对经熊果酸处理过的HL-60细胞进 行琼脂糖凝胶实验，实验结果表明SNU-1细胞和HL-60细胞在持续接触一定时 间后均出现了典型的细胞凋亡。Kim^[16]等在对熊果酸诱导细胞凋亡机制的深入研 究中发现，熊果酸能促进人肝癌(HepG₁2)细胞凋亡，降低HepG₁2细胞活力。 张秋萍^[20]等也研究表明，在40μmol/L的熊果酸作用下，K562细胞呈现凋亡现 象，同时伴有细胞内Bcl-2表达下降，Bax表达升高，Caspase-3被剪切活化， 导致DNA损伤和断裂。

新生血管的形成是肿瘤生长和转移的至关重要的病理过程，事实证明，血 管再生是实体瘤的增长和转移灶形成的重要因素^[21]，而在肿瘤新生血管的形成过 程中，血管内皮细胞(VEC)的活化、增殖、迁移及小管形成是其关键步骤。 Sohn^[22]等以鸡胚胎绒毛试验模型进行的熊果酸抗血管作用研究，结果表明，熊 果酸是很强的血管生成抑制剂。王杰军^[23]的研究表明：137.06～1096.5μmol/L的 熊果酸对VEC的增殖具有抑制作用。熊果酸的抗血管生成作用的机制可能为通 过与糖皮质激素受体或类似的核受体结合发挥作用。

癌是一类生长失去控制，分化差或者去分化的疾病，治疗癌症的新方法之 一就是诱导癌细胞分化为良性或正常细胞。研究表明^[24]，浓度为75μmol/L的熊 果酸可以诱导F9畸胎瘤细胞成为内胚层细胞，并且引起与其分化有关的四型胶 原及维甲酸受体表达增加，且能导致M1细胞分化为巨噬细胞。

发明内容

本发明的目的之一是以熊果酸为先导化合物，对其结构修饰从而合成新衍 生物。

本发明的目的之二是合成一系列新的具有更好药理活性的抗肿瘤药物。

本发明的目的之三是提供以这些化合物作为有效的药用活性成分而用于抗 肿瘤药物，使医生和/或病员在对疾病的防治时能增加对可供使用药物的选择。

本发明以熊果酸A为先导化合物，对其结构修饰合成的化合物，其结构式 如式(I)所示：

所述结构式中，R为

在以式(A)结构的熊果酸为原料合成本发明上述化合物(I)时，可采用下面的 方法制备。

其中，本发明是利用熊果酸的羧基与芳香酮在乙醇的氢氧化钠溶液中发生 Shimdt-Claisen缩合得到α，β-不饱和酮，再将α，β-不饱和酮与盐酸胍并加 入氢氧化钠在无水乙醇中回流反应，反应条件温和，反应较完全，合成了2-氨 基-4-(4-β-D-吡喃阿洛糖苷-苯基)-6-芳基-嘧啶，反应的温度控制、反应物配 料比和反应时间对此反应的成败都非常重要。

由上述内容可以理解，采用上述的合成方式制备本发明所说的化合物(I)， 路线十分简单，成本较低，产物的收率较高，能适合于工业化和扩大生产的需 要。

从上述反应式可以看出，具有如下的工艺步骤：

(1)熊果酸3’-溴代丙醇酯的合成

原料及其配方：

熊果酸和1，3-二溴丙烷的摩尔数之比为1∶2

溶剂    DMF；

催化剂  KI

于100ml圆底烧瓶中依次加入熊果酸4.65g(10mmol)，碳酸钾2.76g(20 mmol)，碘化钾0.05g，40ml DMF，4ml三乙胺，1，3-二溴丙烷4.04g(20mmol)， 60℃搅拌3.5h，反应完毕后冷却至室温，加入120ml水，析出白色固体，抽 滤得到粗品，柱层析纯化，得到目标化合物。

(2)熊果酸-3’-取代丙醇酯衍生物(2a～2j)的合成

于25ml圆底烧瓶中依次加入(1)0.5g(0.85mmol)，碳酸钾0.35g(2.55 mmol)，碘化钾少量，5mlDMF，5滴三乙胺，伯胺类化合物(1.7mmol)，60℃下 搅拌反应，TCL跟踪反应。反应完毕后，冷却至室温，加入20ml水，析出白色固 体，抽滤，得到白色粗产物，用硅胶柱层析纯化，得到目标化合物2a，同法制 得2b～2j.

具体实施方式

下面通过实施例对本发明所述熊果酸-3’-取代丙醇酯衍生物的制备方法作 进一步说明。下述实施例中，“TLC”是指薄层色谱。

实施例1：本实施例制备熊果酸3’-溴代丙醇酯的合成(简称：1)，其结构 式如下：

本实施例的工艺步骤如下

(1)熊果酸3’-溴代丙醇酯(1)的合成

原料及其配方：

熊果酸和1，3-二溴丙烷的摩尔数之比为1∶2

溶剂    DMF；

催化剂  KI

工艺步骤：

于100mL圆底烧瓶中依次加入熊果酸4.65g(10mmol)，碳酸钾2.76g(20 mmol)，碘化钾0.05g，DMF 40mL，4mL三乙胺，1，3-二溴丙烷4.04g(20mmol)， 60℃搅拌3.5h，反应完毕后冷却至室温，加入120mL水，析出白色固体，抽滤得 到粗品，柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)，得到目标化合物熊果酸3’-溴 代丙醇酯。产率62％，m.p.78～79℃。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.74(s， 3H，CH₃)，0.97(s，3H，CH₃)，1.12(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H，CH₃)，1.91(t， J＝4.0Hz，2H，CH₂)，3.21(dd，2H，J＝4.8Hz，J＝.0Hz，H-3)，3.46(t， 2H，J＝6.4Hz，-CH₂Br)，4.12(m，2H，-OCH_2-)，5.28(t，J＝3.6Hz，1H，H-12) ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.34，138.28，125.65，79.02，61.80， 55.23，52.94，48.21，39.08，36.76，28.15，24.25ppm；IR(KBr) v：3377， 2927，2868，1720，1454，1229cm^-1；HRMS(ESI)calcd for C₃₃H₅₃BrO₃[M+H]⁺577.3206，found 577.3381.

实施例2：本实施例制备熊果酸-3’-取代丙醇酯衍生物合成(简称(2a～2j))， 其结构式如下：

本实施例的工艺步骤如下

原料及其配方：

熊果酸3’-溴代丙醇酯和取代基化合物的摩尔数之比为1∶2

溶剂    DMF；

催化剂  KI；

工艺步骤：

于25mL圆底烧瓶中依次加入熊果酸3’-溴代丙醇酯0.5g(0.85mmol)，碳 酸钾0.35g(2.55mmol)，碘化钾少量，DMF 5mL，5滴三乙胺，哌啶0.15g(1.7 mmol)或吗啉0.15g或二乙胺0.15g(1.7mmol)或二甲胺0.15g(1.7mmol) 或哌嗪0.15g(1.7mmol)或咪唑0.12g(1.7mmol)或N-甲基苯胺0.18g(1.7 mmol)或氟尿嘧啶0.22g(1.7mmol)，60℃下搅拌反应，TCL跟踪反应。反应完 毕后，冷却至室温，加入20mL水，析出白色固体，抽滤，得到白色粗产物，用 硅胶柱层析纯化，即得到熊果酸-3’-取代丙醇酯衍生物(简称(2a～2j)

2a：白色絮状固体，产率73％，m.p.91～93℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ： 0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.26(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H，CH₃)， 1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，2.23(d，2H，J＝11.2Hz，N-CH₂)，3.21(dd， 2H，J＝4.8Hz，J＝5.0Hz，H-3)，4.03(m，2H，-OCH₂)，5.29(t，J＝3.6Hz， 1H，H-12)ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.58，138.24，125.52，78.93， 62.89，55.23，52.79，49.40，38.74，36.75，33.03，28.15，24.22ppm；IR (KBr)v：3546，2923，2862，2769，1705，1646，1456，1047cm^-1；HRMS(ESI) calcd for C₃₈H₆₃O₃N[M+H]⁺582.4816，found 582.4797.

2b：白色絮状固体，产率51％，m.p.80～82℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ： 0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.26(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H，CH₃)， 1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，2.43(S，2H，N-CH₂)，3.21(dd，2H，J＝4.8Hz， J＝5.0Hz，H-3)，3.72(s，2H，-OCH₂)，4.03(m，2H，-COOCH₂)，5.29(t，J ＝3.6Hz，1H，H-12)ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.58，138.29， 125.51，79.00，66.86，62.42，55.23，53.23，52.79，48.09，38.74，36.75， 33.03，28.15，24.22ppm；IR(KBr)v：3431，2927，2870，1724，1615， 1457，1039cm^-1；HRMS(ESI)calcd for C₃₇H₆₁O₄N[M+H]⁺584.4609，found 584.4585.

2c：白色粉末固体，产率55％，m.p.62～63℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ： 0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.26(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H，CH₃)， 1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，2.59(d，2H，J＝6.8Hz，N-CH₂)，3.21(dd，2H， J＝4.8Hz，J＝5.0Hz，H-3)，4.03(m，2H，-OCH_2-)，5.24(t，J＝3.6Hz， 1H，H-12)ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.51，138.24，125.53，78.96， 62.57，55.22，52.84，49.40，39.08，36.75，33.03，28.15，24.22ppm；IR (KBr)v：3431，2927，2870，1724，1457，1039cm^-1；HRMS(ESI)calcd for C₃₇H₆₃O₃N[M+H]⁺：570.4816，found 570.4755.

2d：白色絮状固体，产率42％，m.p.70～71℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃) δ：0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.28(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H， CH₃)，1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，2.25(s，6H，N-CH₃)，2.34(s，2H，N-CH₂)， 3.21(dd，2H，J＝4.8Hz，J＝5.0Hz，H-3)，4.03(m，2H，-OCH_2-)，5.28(t， J＝3.6Hz，1H，H-12)ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.52，138.26， 125.52，78.95，62.54，55.23，52.84，48.21，39.08，36.72，28.15，24.22 ppm；IR(KBr)v：3432，2927，2867，2767，1724，1460，1042cm^-1；HRMS(ESI) calcd for C₃₅H₅₉O₃N[M+H]⁺542.4503，found 542.4506.

2e：白色絮状固体，产率57％，m.p.55～56℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ： 0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.28(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H，CH₃)， 1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，2.41(s，6H，N-CH₂)，2.89(s，2H，NHCH₂)， 3.21(dd，2H，J＝4.8Hz，J＝5.0Hz，H-3)，4.03(m，2H，-OCH_2-)，5.28(t， J＝3.6Hz，1H，H-12)ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.52，138.22， 125.49，78.70，62.58，55.23，52.84，48.21，47.51，39.08，36.72，28.15， 26.16ppm；IR(KBr)v：3325，2924，1722，1591，1455，1140cm^-1；HRMS(ESI) calcd for C₃₇H₆₂O₃N₂[M+H]⁺583.4768，found 583.4796.

2f：白色絮状固体，产率33％，m.p.186～188℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ： 0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.28(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H，CH₃)， 1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，3.01(s，2H，，H-3)，4.03(m，2H，-OCH_2-)， 5.17(s，1H，H-12)，6.78(s，1H，imidazole H-4)，7.22(s，1H，imidazole H-5) 7.96(s，1H，imidazole H-2)ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.26，138.34， 137.10，129.72，125.60，118.78，78.88，60.50，55.21，52.97，48.25，47.49， 39.08，38.75，36.97，30.35，28.15，23.30ppm；IR(KBr)v：3381，3113， 2924，2873，1714，1517，1457，1235cm^-1；HRMS(ESI)calcd for C₃₆H₅₆O₃N₂[M+H]⁺565.4299，found 565.4307.

2g：白色絮状固体，产率42％，m.p.68～69℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ： 0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.28(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H，CH₃)， 1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，2.93(s，3H，N-CH₃)，3.22(m，2H，H-3)，4.05(m， 2H，-OCH₂-)，5.24(s，1H，H-12)，6.72(t，2H，Ph-αH)，7.23(dd，J₁＝8.OHz， J₂＝15.2Hz，2H，Ph-βH)ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.55，149.12， 138.21，129.21，125.63，116.35，112.28，78.99，61，98，55.21，52.94， 48.21，47.55，39.08，38.75，36.97，30.35，28.15，23.30，17.12ppm；IR (KBr)v：3437，2925，2869，1723，1600，1506，1453，1140cm^-1；HRMS(ESI) calcd for C₄₀H₆₁O₃N[M+H]⁺604.4659，found 604.4695.

2h：白色固体，产率22％，m.p.133～135℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ： 0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.28(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H，CH₃)， 1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，3.22(m，2H，，H-3)，4.08(m，2H，-OCH_2-)， 5.24(s，1H，H-12)，9.62(s，1H，-CONH-)ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.38， 157.16，149.61，141.12，138.25，128.88，125.61，78.92，61，85，55.21， 52.84，48.21，47.55，39.08，38.73，36.59，30.59，28.15ppm；IR(KBr)：v3443， 3073，2925，2866，1719，1456，1238，1140cm^-1；HRMS(ESI)calcd for C₃₇H₅₅O₅N₂F [M+H]⁺627.4103，found 627.4167.

2i：白色絮状固体，产率50.6％，m.p.82～84℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃) δ：0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.28(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H， CH₃)，1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，2.41(s，6H，N-CH₂)，3.21(m，1H，H-3)， 4.02(m，2H，-OCH₂-)，5.28(t，J＝3.6Hz，1H，H-12)ppm；¹³C NMR(400MHz， CDCl₃)δ：177.52，138.22，125.49，78.70，62.58，55.23，52.84，48.21， 47.51，39.08，36.72，28.15，26.16ppm；IR(KBr)v：3449，2925，2865， 1724，1458，1038cm^-1；HRMS(ESI)calcd for C₇₂H₁₁₄O₆N₂[M+H]⁺1079.8693， found 1079.8727.

2j：白色絮状固体，产率42％，m.p.147～150℃.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ： 0.75(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，1.28(s，3H，CH₃)，1.52(s，3H，CH₃)， 1.91(t，J＝4.0Hz，2H，CH₂)，3.22(m，2H，，H-3)，4.08(m，2H，-OCH_2-)， 5.24(s，1H，H-12)ppm；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：177.38，157.16，149.61， 141.12，138.25，128.88，125.61，78.92，61，85，55.21，52.84，48.21， 47.55，39.08，38.73，36.59，30.59，28.15ppm；IR(KBr)v：3521，2927， 2870，1719，1662，1461，1373，1231，1040cm^-1；HRMS(ESI)calcd for C₇₀H₁₀₇O₈N₂F [M+Na]⁺1145.7888，found 1145.7867.

实施例3生物活性实验

将生长良好的人肺癌细胞A549、人卵巢癌SKOV3细胞、人肝癌细胞HepG2分 别接种于96孔板，2×10³/孔.24h后将不同浓度的试药分别加入板中，100μl/ 孔，培养48h.然后加入MTT溶液10μl(5mg/ml)，37℃作用4h，弃上清，加 入DMSO 150μl/孔，室温振摇30min，测定OD570nm值.根据细胞增殖抑制率公式 计算：抑制率(％)＝(对照组OD值—实验组OD值)/对照组OD值×100％.IC₅₀值利用 统计软件进行计算.实验结果见表1

动物实验的结果表明，本发明的大部分化合物(I)对肿瘤细胞的抑制活性都 较熊果酸更强。

表1目标化合物对肿瘤细胞的抑制活性

注：空白组作为对照组

结果显示，化合物2a、2b、2c、2d和2e对人肺癌A549、人卵巢癌SKOV3、 人肝癌SMMC-7721、人肺癌NCI-H1975、人肝癌Hep G2和人乳腺癌MCF-7细胞 的抑制活性较熊果酸均有所增强。其中化合物2e的抑制活性最高。化合物2f、 2g、2h、2i和2j的抑制活性均没有熊果酸强。由实验结果显示，分子量较小的 化合物2a～2e的生物活性比分子量较大的化合物2f～2j的抑制活性高，结构 中含有二级未饱和氮(化合物2e)的抑制活性比其他化合物的抑制活性高，脂 肪族或脂肪环族含氮结构比芳香族、杂环抑制活性高。进一步深入研究正在进 行中按照上述内容，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，根据本领域 的普通技术知识和惯用手段，对其内容还可以有多种形式的修改、替换或变更。 以上通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的实施内容再进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以上的实例。凡基于本发 明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。