X型胶原蛋白a1(COL10A)高表达与结直肠癌预后的相关性研究

摘要

结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，每年约有140万例新发病例和69万例死亡病例，很多结直肠癌患者由于缺乏简便易行的大规模筛查而被确诊时已是晚期。远处转移，尤其是腹膜和肝转移是导致结直肠癌死亡的主要原因。CRC转移直接导致患者预后差，平均生存时间仅为5-9月。因为早期筛查和治疗的普及，有相当一部分国家已经可以观察到结直肠癌死亡率有所下降。因此，如果能充分应用肿瘤分子生物学研究，选择一些新颖、有特异性的分子标志物来进行早期筛查，那么结直肠癌的早期诊断价值与临床预后会明显提高。
　　在CRC中，原发肿瘤和转移瘤之间存在大量的差异表达基因，进一步明确结直肠癌转移的分子机制具有重要意义。因此，利用基因芯片技术比较了四对结直肠癌原发肿瘤组织及其相应的腹膜转移组织中差异表达的基因，并通过多种方法确定这些差异基因并进行功能注释聚类分析。最终，217个差异表达基因被筛选出来。通过生物信息学分析，qPCR和IHC技术验证，发现了两个基因CTHRC1和COL10A1是结直肠癌转移相关候选基因。在已发表的研究中，证实了异常高表达的CTHRC1是结直肠癌预后的独立危险因素。
　　X型胶原α1链(COL10A1)，是胶原蛋白家族的一个成员。COL10A1基因“编码X型胶原蛋白α链，一个肥大的软骨细胞在软骨内成骨时表达的短链胶原蛋白”。COL10A1基因的突变与日本型脊椎干骺端发育不良(SMD)和Schmid型干骺端软骨发育异常(SMCD)有关。同时，COL10A1的异常高表达已经在多种人类癌症被发现，但详细功能和分子机制目前没有被研究过。
　　笔者的目标是进一步研究COL10A1在结直肠癌中的表达特征，探讨其促进结直肠癌增殖和侵袭的机制，初步阐明COL10A1和结直肠癌之间的临床相关性。
　　本课题分五部分的内容，如下：
　　第一章 COL10A1在结直肠癌组织和细胞中的表达
　　通过荧光定量PCR和Western blot检测40例结直肠癌组织和对应的癌旁正常组织中COL10A1的表达水平。Western blot实验结果表明，COL10A1的表达在33例结直肠癌组织中(T)较邻近的正常组织明显上调(N)(82.5％)(P＜0.001)。QPCR检测结果则表明，在40例对比样本中，25例的癌组织COL10A1表达较邻近的正常组织明显上调(62.5％)。此外，还通过免疫组化方法对30例CRC患者做了进一步的验证。观察到结直肠癌组织比相应的正常组织染色明显更深。这与QPCR和Western blot实验是一致的结果，提示COL10A1在结直肠癌组织中稳定高表达。
　　6株细胞株HCT116、Caco2、SW480、SW620、LoVo、和FHC的COL10A1表达量通过荧光定量PCR和Westernblot法测定。两个实验结果是一致的，即SW480、SW620细胞中高表达COL10A1而其他细胞系中则相对低表达COL10A1。
　　第二章 COL10A1相关的结直肠癌细胞功能研究
　　根据COL10A1在各株细胞中表达量的高低，通过细胞转染技术，选择了HCT116和LoVo细胞结构HCT116-COL10A1-OE和LoVo-COL10A1-OE（过表达）细胞系，而选择SW480和SW620细胞来构建SW480-COL10A1-KD和SW620-COL10A1-KD（敲低）细胞学。细胞转染效率通过QPCR和Western blot实验来检测（P＜0.01）。细胞划痕实验用来测定细胞迁移率。相比较于各自阴性对照细胞，细胞迁移率和迁移能力在HCT116-COL10A1-OE细胞(P＜0.01)和LoVo-COL10A1-0E(P＜0.001)细胞中显著增加。相反，当敲低了COL10A1，细胞迁移率和迁移能力在SW480细胞(P＜0.01)和SW620细胞(P＜0.001)较各自NC组明显降低。Transwell小室迁移和侵袭实验观察到与细胞划痕实验相同的结果（P均＜0.001）。因此，这些结果表明COL10A1显著增加结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。
　　细胞计数试剂盒8(CCK-8)法和克隆形成实验用于研究COL10A1对结直肠癌细胞增殖的影响。在CCK-8实验中，SW480-COL10A1-KD细胞的增殖能力与sw480-nc细胞相比明显降低(P＜0.01)。此外，在克隆形成实验中，SW480-COL10A1-KD细胞的菌落数明显少于SW480-NC细胞(P＜0.001)。因此，敲低COL10A1可以抑制结直肠癌细胞增殖。
　　第三章 COL10A1对动物体内肿瘤生长的影响
　　为探索COL10A1对体内结肠癌细胞生长作用的影响，稳定转染的SW480-COL10A1-KD和SW480-NC分别皮下注射到裸鼠腹部右侧。经过30天的反复观察和测量后，发现SW480-COL10A1-KD组肿瘤生长速度明显慢于SW480-nc组(P＜0.001)。
　　结果表明，敲除COL10A1抑制结直肠癌细胞体内生长。
　　第四章 COL10A1促进EMT过程
　　通过Western blot实验探索COL10A1和EMT现象之间潜在关系。检测的EMT指标包括E-cadherin，N-cadherin，Beta-catenin，Slug and Snail。Western blot实验结果显示，COL10A1过表达促进LoVo和HCT116细胞的EMT过程，相反，当COL10A1被敲低时，SW480，SW620细胞株的EMT过程受到抑制。因此，COL10A1对于EMT过程起到一个正向调节作用。
　　第五章 COL10A1过度表达与结直肠癌预后不良相关
　　包含的197例结直肠癌患者临床资料的组织芯片(TMA)被用来研究COL10A1表达与结直肠癌临床预后的相关性。通过免疫组化分析结果表明，COL10A1的表达与结直肠癌患者预后和生存高度相关。根据Kaplan-Meier log-rank检验，COL10A1异常表达上调(P=0.004)与总生存率差相关。基于单因素生存分析结果选择变量进行多因素生存分析。通过校正，肿瘤大小、分化程度、AJCC分期以及COL10A1表达量被证实为多因素分析的协变量。根据多因素分析结果，AJCC分期(HR4.71，95％CI：2.36-9.39;P＜0.001)和COL10A1高表达(HR2.04，95％CI：1.11-3.74;P=0.022)被认为是总生存率低的独立危险因素。TMA和临床样本的分析结果表明，COL10A1与结直肠癌患者的预后和生存相关。
　　通过研究，得出以下结论：COL10A1在结直肠癌组织中高表达，并参与结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长的过程。同时，COL10A1促进EMT过程。COL10A1高表达可作为结直肠癌预后和总生存率的一个独立危险因素。在未来，COL10A1可能是结直肠癌治疗的一个潜在的靶基因。

目录

摘要

前言

第一章 COL10A1在结直肠癌组织和细胞中的表达

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

第二章 COL10A1相关的结直肠癌细胞功能研究

1、材料与方法

2．结果

3、讨论

第三章 COL10A1对动物体内肿瘤生长的影响

1、材料与方法

2．结果

3、讨论

第四章 COL10A1促进EMT过程

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

第五章 COL10A1过度表达与结直肠癌预后不良相关

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

全文小结

参考文献

中英文缩略词表

攻读硕士期间成果

致谢

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