MCM6通过MEK/ERK通路促进肝癌的侵袭转移并可作为预测早期复发的血液学指标

摘要

原发性肝癌是全球肿瘤相关致死率位居第二的恶性肿瘤，每年超过一半的新发病例和死亡病例发生在中国。肝癌起病隐匿，进展迅速，预后极差;多数患者即使接受根治性肝癌切除，术后仍会出现肝内或肝外转移，其中术后（1年内）早期复发是影响肝癌患者长期生存的主要因素。
　　MCM6基因在多种肿瘤中发挥促癌作用，但在肝癌领域内的研究相对局限，尤其关于肝癌侵袭转移及早期复发中的功能及其机制的研究，尚未见报道。
　　目的和意义：
　　1.明确MCM6在人肝癌细胞系、肝癌组织及其匹配癌旁无瘤肝组织中的表达水平，及其在肝癌患者预后评估的价值;
　　2.探讨肝癌发生发展过程中MCM6的功能及调控机制，以寻求肝癌侵袭转移新的理论依据;
　　3.评价血清MCM6表达水平在肝癌根治切除术后早期复发中的预测价值。
　　内容与方法：
　　1.MCM6在肝癌组织中的表达及其与肝癌临床病理参数的关系
　　(1)免疫组织化学染色法检测70例肝癌组织及其匹配癌旁肝组织和30例正常肝组织中MCM6的表达情况;
　　(2)通过Kaplan-Meier生存分析、log-rank检验及单因素、多因素COX回归模型，分析MCM6表达与肝癌患者预后的关系;通过x2检验或Fisher概率法分析MCM6表达与患者临床病理参数间的关系;
　　(3)基于生物信息学技术，利用TCGA数据库分析291例HCC患者MCM6mRNA表达与总生存期数据：根据MCM6mRNA中位表达量，将患者分为高表达及低表达两组，比较两组患者间的生存期差异，绘制Kaplan-Meier生存曲线，从mRNA水平验证MCM6的表达与肝癌预后的关系。
　　2.MCM6对肝癌细胞体内外侵袭转移能力的影响
　　(1)实时荧光定量PCR和Western blot检测肝癌细胞中MCM6表达水平;
　　(2)构建稳定敲除MCM6的shMCM6-HCC-LM3和shMCM6-SMMC7721细胞株;
　　(3)体外实验验证MCM6对细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;
　　(4)裸鼠皮下成瘤和肝包膜移植瘤模型验证MCM6对肿瘤生长和肝内外转移的影响，并用免疫组织化学染色技术对皮下肿瘤EMT相关因子进行检测;
　　(5)实时荧光定量PCR、Western blot及细胞免疫荧光染色等技术检测EMT相关蛋白表达水平，同时对MEK/ERK通路相关指标进行检测，以明确MCM6促进肝癌侵袭转移的分子机制。
　　3.血清MCM6表达水平对肝癌术后早期复发的预测价值
　　(1)采用ELISA试剂盒检测肝癌、肝硬化患者及健康人群血清中MCM6表达水平，并对各组间的表达差异进行统计分析;
　　(2)检测肝癌患者行肝癌根治性切除术前后血清MCM6浓度，并对血清MCM6水平与HCC早期复发进行相关性分析;
　　(3)就术后血清MCM6表达水平，通过ROC曲线确定其预测早期复发的cut-off值;根据曲线下面积，比较MCM6单独或联合血清AFP检测时，对肝癌早期复发的预测能力。
　　结果：
　　1.MCM6在正常肝组织中不表达，在肝癌组织中的表达水平明显高于匹配的癌旁组织，其表达主要定位于细胞核;MCM6高表达的患者，术后易复发，生存期较短，MCM6可作为肝癌患者不良预后的独立影响因素;
　　2.MCM6在体内外均可促进肝癌细胞的增殖、侵袭与迁移;
　　3.MCM6通过激活MEK/ERK信号通路诱导肝癌细胞发生EMT改变，从而促进肝癌细胞的侵袭与转移;
　　4.术后血清MCM6高表达与早期复发密切相关;联合检测血清MCM6和AFP能显著提高肝细胞癌术后早期复发的预测能力。
　　结论：
　　MCM6基因在肝癌发生、发展过程中发挥促癌作用，其高表达提示患者预后不良;MCM6可通过激活MEK/ERK通路来诱导肝癌细胞发生EMT改变，从而促进肝癌侵袭与转移，这为明确肝癌侵袭转移机制提供了新的思路，同时有望成为临床潜在的治疗靶点;外周血MCM6有望成为监测肝癌患者术后早期复发的一项敏感、可靠的无创血清学标志物。

目录

摘要

前言

第一章 肝癌组织中MCM6表达及其与患者临床病理参数的关系

一 材料和方法

二 结果

三 讨论

第二章 MCM6对肝癌侵袭转移的影响及其机制研究

一 材料和方法

二 结果

三 讨论

第三章 血清MCM6对肝癌术后早期复发的预测价值

一 材料和方法

二 结果

三 讨论

全文小结

参考文献

中英文缩略词

既往发表过的论文

致谢

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