KIF15通过MEK-ERK信号通路促进胰腺癌细胞的增殖及侵袭转移

摘要

第一部分：KIF15在胰腺癌组织中的表达及临床意义　　目的：筛选胰腺癌潜在的基因治疗靶点，并扩大样本量在胰腺癌患者组织中进行检测，探讨KIF15在胰腺癌组织中的表达及临床意义。　　方法：采用Agilent mRNA表达谱基因芯片（mRNA microarray）分析7例胰腺癌组织及健康对照组织中差异表达的mRNA；从基因芯片中选取了22个表达差异明显的mRNA，通过高含量siRNA筛选（high-content siRNA screening）验证基因芯片的结果并验证其功能；免疫组织化学检测90例胰腺癌及相应癌旁正常胰腺组织中KIF15的表达，并分析KIF15的表达量与临床病理、临床分期以及预后关系；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测27例胰腺癌及相应癌旁正常胰腺组织中KIF15的表达。　　结果：1.mRNA基因芯片显示差异表达的基因有1460个，其中胰腺癌患者组织中高表达的有892个，低表达的有568个；2.高含量siRNA筛选显示通过干扰22个表达差异明显的mRNA，其中有四个基因（KIF15、FAM54A、GMFB、ZWINT）能有效抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖，并且KIF15的效果最佳；3.免疫组织化学显示KIF15在胰腺癌组织中高表达(P<0.05)且主要分布于胞质中，而在对应的癌旁正常胰腺组织中KIF15低表达；KIF15的表达量与NCCN临床分期的关系：临床分期越高，KIF15的表达量越高（P<0.05）；KIF15的表达量与病理分期无统计学意义；KIF15的表达量与肿瘤是否发生侵袭转移密切相关（P<0.01）。KIF15在胰腺癌组织中的表达量与患者生存期呈负相关（P<0.05）；4.qRT-PCR显示KIF15在胰腺癌组织中高表达（P<0.001）。　　结论：KIF15在胰腺癌患者组织中高表达，且与预后不良相关；KIF15可能在胰腺癌的发生发展或者生物学效应中扮演重要角色，可以作为进一步研究对象。　　第二部分：KIF15对胰腺癌细胞增殖能力的影响　　目的：探讨KIF15对胰腺癌细胞体内、体外增殖能力的影响。　　方法：设计干扰KIF15表达的siRNA序列，构建稳定表达的KIF15过表达、抑制表达以及阴性对照慢病毒载体，并将siRNA和慢病毒载体分别转（感）染胰腺癌PANC-1和MIA PaCa-2细胞，qRT-PCR检测转（感）染效率；Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验检测KIF15对胰腺癌细胞增殖能力的影响；流式细胞术检测KIF15对胰腺癌细胞周期及凋亡的影响；体内建立裸鼠皮下成瘤模型，模拟体内环境中KIF15对胰腺癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。免疫组化实验检测KIF15在瘤体内对Ki67表达的影响。Western bolt检测周期蛋白的表达。　　结果：成功设计si-KIF15序列并成功构建慢病毒载体，CCK-8实验结果显示上调KIF15的表达可显著促进胰腺癌细胞的增殖能力（P<0.05），下调KIF15表达则显著抑制胰腺癌细胞的增殖能力（P<0.05）；流式细胞术显示，抑制KIF15表达使胰腺癌细胞周期阻滞在G1期（P<0.05）；而KIF15的表达对胰腺癌细胞凋亡无明显影响，差异无统计学意义；裸鼠皮下成瘤实验显示，下调KIF15的表达能显著抑制胰腺癌细胞裸鼠皮下成瘤的能力（P<0.05）；免疫组化显示，下调KIF15的表达能抑制Ki67的表达。Western bolt结果显示：KIF15能促进周期蛋白cyclinD1、CDK2、P-RB等表达上调，导致G1/S期转换，而下调KIF15则抑制上诉蛋白的表达，使细胞阻滞在G1期。　　结论：KIF15能促进胰腺癌细胞的增殖，下调KIF15能抑制胰腺癌细胞的皮下成瘤能力，其抑制作用可能部分是通过阻滞胰腺癌细胞周期处于G1期而实现的。　　第三部分：KIF15对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响　　目的：探讨KIF15对胰腺癌细胞体内、体外侵袭转移能力的影响。　　方法：在体外，采用transwell侵袭、迁移实验检测KIF15对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响；免疫荧光实验检测细胞骨架蛋白的变化。在体内，建立裸鼠脾脏肝肺转移模型，模拟KIF15在体内环境中对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响。Western bolt检测KIF15对基质金属蛋白酶表达的影响。　　结果：transwell侵袭、迁移实验显示上调KIF15表达，相对于阴性对照，能显著促进胰腺癌细胞的侵袭转移能力，而下调KIF15表达，相对于阴性对照，则显著抑制胰腺癌细胞的侵袭转移能力，差异均有统计学意义（P<0.05）;免疫荧光实验显示，下调KIF15表达， 细胞骨架蛋白F-actin被剪切，呈现低表达，丧失运动结构和极性，而对照组细胞骨架蛋白F-actin未被剪切，呈现高表达，为细胞运动提供了必要的运动结构和极性；裸鼠脾脏肝肺转移模型显示，过表达KIF15，能导致肝脏及肺脏转移灶明显多于阴性对照组（P<0.05），且生存周期较阴性对照组明确缩短（P<0.05）,裸鼠体重较阴性对照组也明显降低（P<0.05），低表达KIF15，则能抑制胰腺癌细胞向肝脏及肺脏的转移，延长裸鼠的生存周期，增加裸鼠的体重。过表达KIF15能促进MMP2、MMP14的表达.　　结论：KIF15能促进胰腺癌细胞的侵袭转移能力，且能促进裸鼠体内胰腺癌细胞向肝、肺转移的能力，缩短生存期，导致恶病质的形成；下调KIF15表达，则侵袭转移能力能被抑制，细胞骨架蛋白F-actin被剪切，不能为间充质移动方式向阿米巴样移动方式的转变提供必要的运动结构和极性，从而迁移能力变弱，且下调KIF15表达后能改善裸鼠生存状况，抑制裸鼠体内胰腺癌细胞的远处转移。KIF15能促进MMP2、MMP14的表达，有助于细胞外基质的重塑，促进胰腺癌细胞的转移。　　第四部分：KIF15通过激活MEK-ERK信号通路调控胰腺癌细胞的增殖及侵袭转移　　目的：探讨KIF15促进胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的相关机制。　　方法：通过Agilent mRNA基因芯片分析3对胰腺癌KIF15基因敲除细胞和阴性对照细胞差异表达的mRNA，发现当敲除KIF15基因，MEK-ERK信号通路中的多个关键基因的mRNA水平均下调，另外通过网络调控信号通路分析MEK-ERK信号通路与KIF15联系最为密切，故初步确定KIF15参与激活MEK-ERK信号通路；Western bolt实验检测KIF15对MEK-ERK信号通路相关蛋白表达的影响；免疫荧光实验检测KIF15与MEK-ERK信号通路关键蛋白共定位情况以及P-ERK入核情况；免疫共沉淀实验检测KIF15与MEK-ERK信号通路关键蛋白相互作用的情况；应用MEK-ERK信号通路阻滞剂（PD98059、U0126、AZD6244）观察生物学效应是否改变，通路相关蛋白及下游靶蛋白表达水平是否改变；建立裸鼠肝肺转移模型，应用PD98059阻滞剂后，检测裸鼠生存状况及肝肺转移灶情况。　　结果：Western bolt结果显示，上调KIF15表达，能促进MEK-ERK信号通路关键蛋白P-c-Raf、P-MEK、P-ERK等表达上调，下调KIF15表达则上诉结果下调；免疫共沉淀结果显示KIF15与通路关键蛋白P-MEK、P-c-Raf有相互作用；免疫荧光结果显示，KIF15与通路关键蛋白P-MEK、P-c-Raf有共定位现象，且干扰KIF15后KIF15、P-MEK、P-c-Raf的表达量均减少；下调KIF15表达，能抑制P-ERK从胞质转向胞核；应用通路阻滞剂后，过表达KIF15后的生物学效应被抑制，表达增高的通路相关蛋白及下游靶蛋白表达水平受到抑制，裸鼠肝肺转移模型显示，应用MEK-ERK通路阻滞剂PD98059后，过表达KIF15促进远处转移灶形成、缩短生存周期、降低生存状况的情况得以改善。　　结论：KIF15能直接作用于P-c-Raf或者P-MEK，从而激活P-ERK，进而激活MEK-ERK信号通路；P-ERK入核促进cyclinD1、CDK2、P-RB等转录，使蛋白表达上调，细胞周期由G1期向S期转变，从而促进细胞的增殖；P-ERK入核促进基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-14的转录，导致蛋白表达增高，使基质降解加快，从而促进细胞的侵袭转移；应用MEK-ERK信号通路阻滞剂后，KIF15的促进作用被抑制。

目录

声明

第一部分：KIF15在胰腺癌组织中的表达及临床意义

0 引言

1.1 材料与方法

1.2 结 果

1.3 讨论

1.4 结论

参考文献

第二部分：KIF15对胰腺癌细胞增殖能力的影响

0 引 言

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 结论

参考文献

第三部分：KIF15对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响

0 引 言

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 结论

参考文献

第四部分：KIF15通过MEK-ERK信号通路调控胰腺癌细胞的增殖及侵袭转移的机制

0 引 言

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 结论

参考文献

综述：KIF15的研究进展

作者简历

致谢

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