蛋白酶体依赖的MCM7降解导致肿瘤休眠介导紫杉醇耐药

摘要

目的：
　　应激条件下，肿瘤细胞会进入休眠（dormancy or quiescence），当外界环境合适时，休眠肿瘤细胞会重新活化进入增殖周期，导致复发和转移。但是目前关于肿瘤细胞进入休眠调控机制仍不清楚。
　　肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)是肿瘤组织内一群能自我更新和分化的肿瘤细胞，是肿瘤耐药、复发和转移的根源。研究表明CSCs与休眠密切相关，大部分CSCs处于休眠期，但“干性”与“休眠”之间的相互关系尚不明确，诱导“休眠”的信号是否会同时诱导“干性”表型？这方面研究尚鲜有报道。
　　方法:
　　增殖的肿瘤细胞具有独特的代谢以及酸碱调节特点。增殖的肿瘤细胞主要通过有氧糖酵解（即Warburg Effect），产生能量。虽然糖酵解会使胞内酸性产物增多，但是肿瘤细胞通过增强钠氢交换体(NHE1)活性加大H+外排能力，从而使胞内偏碱性而胞外偏酸性，最终造成翻转的（与正常细胞相比）胞内外酸碱梯度。但休眠肿瘤细胞中，代谢及酸碱梯度呈现怎样的特点，以及其对休眠的调控作用尚不清楚。
　　结果:
　　MCM7是复制前复合体的一员，参与起始复制和延伸DNA，与增殖密切相关。近期研究表明，MCM7可作为转录因子和共转录因子，参与表观遗传调控。在休眠中的作用尚未见报道。
　　MCM7后，发现p-CDK1升高，Cohesin/RAD21减少，细胞退出M期时间减少，并且异常有丝分裂增多。
　　结论:
　　1.肿瘤细胞进入休眠并随后发生转化获得“干性”抵抗紫杉醇杀伤;
　　2.酸性胞内环境会激活UPS，促进周期相关蛋白降解，促进肿瘤细胞进入休眠;
　　3.MCM7的降解，一方面抑制E2F1活性，阻止细胞进入分裂周期;另一方面能抑制CDK1活性，促进Cohesin/RAD21降解，加速退出分裂周期。

目录

摘要

前言

第一章 紫杉醇诱导休眠肿瘤干细胞

1．1 实验材料

1．1．1 实验细胞

1．1．2 主要实验试剂

1．1．3 主要实验器材

1．1．4 主要试剂配置

1．2．1 紫杉醇处理肿瘤细胞

1．2．2 紫杉醇诱导耐药细胞

1．2．5 实时定量基因扩增荧光检测(real time-PCR)

1．2．6 MTS检测细胞存活率

1．2．7 EdU增殖检测试剂盒检测增殖能力

1．2．8 RIPA提取细胞总蛋白

1．2．9 Western-blot检测蛋白表达

1．2．10 统计学分析

1．3．1 紫杉醇诱导肿瘤细胞多药耐药并获得“干性’’

1．3．2 肿瘤干细胞处于不活跃的休眠期

1．3．3 高浓度紫杉醇诱导耐药细胞进入休眠

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 紫杉醇通过降低pHi促进耐药肿瘤细胞休眠

2．1 实验材料

2．1．1 实验细胞

2．1．2 主要实验试剂

2．1．3 主要实验器材

2．1．4 主要试剂配置

2．2 实验方法

2．2．2 pHi标准曲线绘制

2．2．3 测定pHi

2．3．2 休眠肿瘤细胞NHE1表达下调

2．3．3 NHEl抑制剂Cariporide降低耐药细胞pHi，并抑制增殖

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 酸性胞内环境通过激活泛素蛋白酶体系统降解MCM7促进耐药细胞休眠

3．1 实验材料

3．1．1 实验细胞

3．1．2 主要实验试剂

3．1．4 主要试剂配置

3．2 实验方法

3．2．2 染色体免疫沉淀(CHIP)

3．2．3 免疫共沉淀(CoIP)

3．3 实验结果

3．3．1 酸性胞内环境下，蛋白泛素化水平升高

3．3．2 MG-132抑制蛋白酶体活性，胞内蛋白泛素化水平升高

3．3．3 高浓度紫杉醇诱导MG-132处理的耐药细胞凋亡

3．3．4 酸性胞内环境通过激活泛素蛋白酶体系统降解增殖相关蛋白

3．3．5 紫杉醇通过降解MCM7，抑制E2F1活性

3．3．6 干扰MCM7表达抑制肿瘤休眠再活化

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 干扰MCM7通过抑制CDK1活性，促进有丝分裂退出

4．1．1 实验细胞

4．1．2 主要实验试剂

4．1．3 主要实验器材

4．1．4 主要试剂配置

4．2 实验方法

4．2．1 胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法同步化细胞

4．2．2 流式细胞术检测细胞周期

4．2．3 Chromatin-binding assay分离染色质与非染色质蛋白

4．2．4 RNA干扰MCM7表达

4．2．5 诺考达唑同步化细胞

4．2．6 免疫组化检测MCM7表达

4．3．1 MCMs mRNA在不同细胞周期的表达

4．3．2 MCM4，MCM6和MCM7在G2／M期稳定结合在染色质上

4．3．3 MCM7在整个有丝分裂中期都有表达

4．3．4 干扰MCM7表达促进M期退出

4．3．5 干扰MCM7表达导致异常有丝分裂

4．4 讨论

4．5 小结

总结

参考文献

攻读硕士期间成果

致谢

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