新型噻吩类秋水仙碱位点微管蛋白抑制剂的设计、合成和抗肿瘤机制研究

摘要

目的：
　　秋水仙碱位点的微管蛋白抑制剂自发现以来，由于其特殊的结构和强抗癌活性，一直受到科学家们的关注，是微管蛋白抑制剂研究领域的热点之一，但目前仍未有上市治疗肿瘤的药物。借鉴秋水仙碱位点微管蛋白聚合抑制剂噻吩衍生物105与4-取代的苯甲酰基噻唑SMART195的苯甲酰基支架，我们设计、合成了一系列新型的5-芳基炔基-2-苯甲酰基噻吩类化合物(PST)，并研究其抑制微管蛋白聚合与抗肿瘤的作用机制。
　　方法：
　　1.将5-苯基乙炔基部分引入到具有苯甲酰基支架的噻吩核中进行药物设计、合成并评价新型的具有5-芳基炔基-2-苯甲酰基噻吩结构的小分子化合物，在Schr(ε)odinger程序中对PST系列化合物的药动学性质进行预测，分子对接模拟实验研究PST-3与微管蛋白的结合位点，并评价PST系列化合物在体外对肿瘤细胞增殖与克隆形成能力的影响，急性毒性实验评价PST-3的体内毒性。
　　2.免疫荧光染色实验、微管蛋白聚合抑制实验、Western blot以检测PST-3与微管蛋白的结合位点，以及其对微管形态、动力学、表达量的影响;使用流式细胞术及Western blot检测PST-3对细胞周期进程与凋亡的影响;构建乳腺癌异种移植动物模型在体内验证PST-3的抗肿瘤活性。
　　3.MTT法检测PST-3与Dox联合用药对乳腺癌细胞增殖的影响。PCR法、Western blot法、双荧光素酶报告基因检测PST-3与多柔比星联用对乳腺癌细胞的miR-21与PTEN的影响。流式细胞术AnnexinV/PI双染法定量检测PST-3与多柔比星联用对乳腺癌细胞凋亡的诱导作用。体内抗肿瘤实验验证PST-3与多柔比星联用在体内对乳腺癌MCF7、T47D的抗肿瘤活性。
　　结果：
　　1.所有PST化合物预测的药代动力学特征在允许范围内，分子对接模拟实验表明PST-3化合物PST-3与微管蛋白的秋水仙碱位点具有相互作用。基于以上结果合成并鉴定了一系列新型的5-芳基炔基-2-苯甲酰基噻吩类化合物。PST系列化合物对多种细胞有抗肿瘤活性，IC50值达到μM级别。其中活性最强的PST-3，在抑制肿瘤细胞增殖的同时，对正常的乳腺上皮细胞在治疗剂量下却几乎没有细胞毒性;而在体内的急性毒性试验中，PST-3的LD50值(＞2000mg/kg)远大于阳性对照药物秋水仙碱(17.08mg/kg)。
　　2.免疫荧光染色实验、微管蛋白聚合抑制实验及Westem blot均表明，PST-3处理后可抑制乳腺癌细胞的微管蛋白聚合，与秋水仙碱的作用相似，使得细胞内α、β微管蛋白发生断裂，正常的微管网状结构被破坏，但对α、β微管蛋白表达量无明显影响。PST-3能够阻滞乳腺癌细胞周期于G2/M期，并诱导细胞凋亡，在体内实验中PST-3的肿瘤抑制率达到88.25％，抗肿瘤效果优于阳性对照药物秋水仙碱，同时对实验动物的体重无明显影响。
　　3.双荧光素酶报告基因、Western blot及PCR检测确认了PTEN是miR-21直接调控的靶基因，PST-3通过上调miR-21表达从而抑制PTEN的表达，最终显著增强对多柔比星诱导的细胞凋亡。体内抗肿瘤实验中，单独使用PST-3基本不产生细胞凋亡，PST-3与多柔比星联用能够显著增强多柔比星诱导的细胞凋亡，抑制体内肿瘤的生长，与单一药物组相比，具有统计学异差(p＜0.001)。
　　结论：
　　1.首次合成并鉴定了一系列新型的5-芳基炔基-2-苯甲酰基噻吩类化合物。
　　2.PST系列化合物具有广泛的抗肿瘤活性，其中PST-3的活性最强且低毒，具有进一步研究的价值。
　　3.PST-3是作用于秋水仙碱位点的微管蛋白抑制剂，在体内外具有良好的抗肿瘤活性。
　　4.PST-3通过miR-21/PTEN途径提高乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性，在体内外协同增强多柔比星的抗肿瘤作用。

目录

摘要

前言

第一章 设计、合成、筛选新型噻吩类小分子微管蛋白抑制剂(PST)

材料与方法

结果

第二章 PST系列化合物的抗肿瘤机制研究

材料与方法

结果

第三章 PST-3与多柔比星联合用于治疗乳腺癌的作用机制研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 癌症治疗的新靶点PTEN：RTK依赖性PI3K和Akt信号调节因子

硕士期间取得的成果

致谢

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