MiR--577在胃癌中通过SDPR/ERK/NF--κB正反馈环路调控TGFβ诱导的EMT和干性

摘要

研究目的： 上皮间质转化(EMT)是肿瘤转移的重要机制之一。肿瘤干细胞(Cancer stem cell，CSC)是指肿瘤中少部分具有自我更新、肿瘤起始和化疗抵抗特性的细胞群体，肿瘤干性(Stemness)即指的是这部分肿瘤细胞所拥有的特性，常见的干性标志物包括CD133、CD44、Sox2等。研究发现，EMT是驱动肿瘤细胞获得肿瘤干性的重要过程。 通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库分析，我们发现miR-577在胃癌中明显上调，体内体外的实验研究证实miR-577促进胃癌侵袭、转移、EMT和肿瘤干性，但不影响胃癌增殖。通过多种细胞因子筛选，我们发现TGFβ显著诱导miR-577的表达，通过转录组学分析证实NF-κB P65是miR-577的转录因子，TGFβ通过活化NF-κB，磷酸化P65，入核转录调控miR-577的表达。通过生物信息分析和实验验证，我们证实SDPR蛋白为miR-577的下游靶基因，SDPR通过直接与ERK结合，抑制ERK磷酸化，影响ERK-IKKα/β-IKBα-P65通路，从而抑制P65磷酸化，正反馈抑制miR-577的转录。 结合生物信息分析和实验验证，我们发现miR-577及其靶基因SDPR是TGFβ介导EMT的重要机制，通过正反馈环路促进胃癌转移，本研究拟探讨miR-577及其靶基因如何参与TGFβ介导的EMT，为未来针对miR-577和SDPR为靶点实现精准治疗提供实验依据。 研究方法： 1.miR-577在胃癌细胞、组织和临床标本的表达水平 (1)通过对TCGA STAD(The Cancer Genome Atlas Stomach Adenocarcinoma)数据库microRNA芯片进行分析，筛选胃癌差异microRNAs，miR-577是差异基因之一并在胃癌中高表达。 (2)采用荧光定量RT-PCR检测36例新鲜胃癌组织标本及其配对的癌旁正常黏膜组织，7株胃癌细胞株(AGS、SGC7901、MGC803、MGC823、BGC823、BGC803、MKN45)和正常永生化胃粘膜上皮细胞GSE-1中miR-577的表达。 (3)通过对153例有完整随访资料的胃癌石蜡标本进行原位杂交，分析miR-577的表达与临床病理学参数以及患者预后的关系。 2.miR-577对胃癌细胞体内外生物学特性的影响 (1)通过转染miR-577AgomiR/AntagomiR用于miR-577的过表达和干扰，通过MTT实验、Edu细胞增殖实验、平板克隆实验等检测miR-577在体外对胃癌细胞增殖能力的影响;通过构建带Luciferase信号的LV-miR-577稳定过表达细胞及其对照细胞，裸鼠皮下瘤注射实验检测miR-577在体内对胃癌细胞增殖的影响。 (2)瞬时转染miR-577AgomiR/AntagomiR后，Transwell细胞迁移实验检测miR-577体外对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响;通过构建带Luciferase信号的LV-miR-577稳定过表达细胞及其对照细胞，裸鼠尾静脉瘤细胞注射实验检测体内miR-577对胃癌细胞肺定殖能力的影响以及分析与裸鼠生存预后的关系。 (3)瞬时转染miR-577AgomiR/AntagomiR后，干性成球实验检测miR-577对胃癌细胞成球能力的改变;MTT实验检测miR-577对奥沙利铂化疗敏感性的影响;将细胞分为NC组、miR-577组、NC+奥沙利铂组、miR-577+奥沙利铂组，通过流式细胞技术检测miR-577对凋亡的影响，并通过Western Blot检测凋亡相关指标的改变。 3.miR-577参与TGFβ介导EMT的机制研究 (1)倒置显微镜观察瞬时转染miR-577AgomiR/AntagomiR后胃癌细胞形态的变化，利用Western Blot、免疫组化和免疫荧光检测EMT和肿瘤干性相关标志物的变化。 (2)使用TGFβ刺激胃癌细胞0H、24H、48H，倒置显微镜观察细胞形态学变化，Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化，Western Blot检测EMT标志物的改变，荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化。 (3)将细胞分为TGFβ对照组、TGFβ处理组、TGFβ+AntagomiR处理组，倒置显微镜观察细胞形态学变化，Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化，Western Blot检测EMT标志物的改变。 (4)使用基因组学网站UCSC和转录因子数据库PROMO分析发现NF-κB P65是miR-577的转录因子，存在A、B、C3个结合位点，TGFβ刺激胃癌细胞0H和24H，Western blot检测NF-κB P65磷酸化改变，免疫荧光观察NF-κB P65定位的改变。 (5)使用NF-κB通路抑制剂QNZ和BAY11-7082，Western Blot检测P-P65和P65的表达，荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化;设计特异性siRNA干扰NF-κB P65，Westem Blot检测P65变化，荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化。 (6)构建启动子荧光素酶报告基因载体，分组为PGL4+P65组、WT+P65组、MUTAB+P65组、MUTAC+P65组、MUTBC+P65组、MUTABC+P65组，检测荧光素酶活性变化;根据A、B、C3个位点设计特异性探针，CHIP实验验证NF-κB P65与启动子区位点直接结合。 4.miR-577靶基因的筛选和鉴定 (1)通过靶基因数据库miRDB、PITA、RNA22和Targetscan分析miR-577潜在调控的靶基因，TCGA分析靶基因在胃癌中的表达水平及其相应的表达丰度;荧光定量RT-PCR分析过表达miR-577后靶基因的变化;构建靶基因3'UTR区域双荧光素酶载体，验证miR-577与靶基因3'UTR区直接结合。 (2)荧光定量RT-PCR分析选定的靶基因SDPR在30例胃癌新鲜临床组织标本及其癌旁配对正常胃粘膜组织中的表达，并分析SDPR与miR-577表达在新鲜组织水平的相关性。 (3)对153例有完整随访资料的石蜡包埋胃癌组织进行SDPR免疫组化染色，分析SDPR与临床病理参数和患者预后的关系。 (4)设计特异性siRNA干扰SDPR，构建SDPR过表达载体，倒置显微镜观察形态学变化，Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化，Western Blot检测EMT标志物的改变; (5)免疫荧光共染SDPR和ERK，CO-IP验证SDPR与ERK相互作用，Western Blot检测ERK/NF-κB通路指标的改变。 (6)过表达和干扰SDPR，荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化。 研究结果： 1.miR-577在胃癌组织水平和细胞水平高表达 (1)TCGA芯片分析提示miR-577在胃癌高表达 通过对TCGA胃癌microRNA芯片进行分析，在42对胃癌及其配对的癌旁正常组织中，有29对癌组织中miR-577表达上调。 (2)miR-577在胃癌组织水平和细胞水平高表达 通过对36对胃癌及其癌旁配对正常组织进行荧光定量RT-PCR检测，发现与癌旁正常组织相比，miR-577在胃癌组织中表达上调，并且肿瘤分期为Ⅲ+Ⅳ胃癌患者组织较Ⅰ+Ⅱ期中的miR-577表达更高，转移组(M1)较非转移组(M0)的miR-577表达也更高。细胞水平上，较永生化胃粘膜上皮细胞GSE-1，miR-577在6株胃癌细胞中的表达均上调。 以上实验说明，miR-577在胃癌中高表达，并与患者转移和不良预后相关，可能是评估胃癌患者转移和预后的作为独立预测指标。 2.miR-577不影响增殖但促进转移和化疗耐药 以上实验说明，miR-577不影响胃癌细胞增殖能力，但促进胃癌细胞体内外迁移、侵袭、肺定殖能力、成球能力和化疗抵抗能力。 3.miR-577参与TGFβ诱导的EMT和肿瘤干性 该部分研究结果说明miR-577是TGFβ的新靶点，TGFβ通过调控NF-κBP65核转位，转录水平调控miR-577的表达，介导肿瘤EMT和肿瘤干性。 4.SDPR是miR-577的下游靶基因 该部分实验说明SDPR作为miR-577的靶基因，在胃癌细胞中通过与ERK直接结合，抑制ERK磷酸化，抑制ERK/NF-κB通路，一方面抑制EMT和干性，另一方面则抑制miR-577的转录，通过正反馈环路调节miR-577的表达。 研究结论： 1、miR-577在胃癌中高表达，与肿瘤转移和不良预后相关，可能扮演癌基因角色; 2、miR-577不影响胃癌增殖但促进胃癌细胞体内体外的迁移、侵袭和肺定殖能力; 3、TGFβ通过NF-κB转录调节miR-577，介导EMT和胃癌干性; 4、SDPR是miR-577的下游靶基因，调控ERK/NF-κB通路，一方面抑制EMT和肿瘤干性，另一方面正反馈调节miR-577的表达。

目录

摘要

前言

第一章miR-577在胃癌细胞、组织和临床标本的表达

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二章miR-577在胃癌中体内体外的生物学功能

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第三章miR-577参与TGFp诱导的EMT和肿瘤干性

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第四章miR-577靶向SDPR／ERK／NF-κB正反馈环路

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

全文小结

研究机制图

参考文献

博士研究生期间研究成果

致谢

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