大蒜果聚糖代谢酶及黑蒜中糖与5-HMF的研究

摘要

大蒜果聚糖是大蒜中的重要活性成分之一。在大蒜生长、贮存过程中,大蒜果聚糖代谢酶对大蒜果聚糖的分子特征有着重要的影响。为明确大蒜中果聚糖的变化规律,本论文采用硫酸铵盐析法粗分大蒜果聚糖合成酶(FBE)及大蒜果聚糖水解酶(FEH),用ConA Sepharose亲和层析、DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Superdex200凝胶过滤层析等方法对其予以细分,进而采用denovo测序法测定目的条带的氨基酸序列,然后与其它植物中的1-FEH以及大蒜克隆的FEH进行序列比对。此外,用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定黑蒜加工过程中的果糖和蔗糖;用苯酚硫酸法测定其总果聚糖;用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定其5-羟甲基糠醛(5-HMF)的变化规律。取得了如下结果:
　　(1)部分纯化了1-FEH,对Pro-gel分析所得条带进行测序得到该酶的两个肽段的氨基酸序列,分别是PADHYPAYMNDTNR和ILKSGKHGPKCGEGER,但经BLAST序列比对发现此条带不同于已经发现的其他植物1-FEH,可能是一新型的果聚糖水解酶。
　　(2)证实1-SST活性主要存在于30％-40%硫酸铵沉淀部分的粗酶液中。
　　(3)建立HPLC-ELSD分离六种糖的分离方法,其分离方法为:Prevail carbohydrate ES糖柱梯度洗脱,梯度条件为:0 min,75%乙腈水;15 min,65%乙腈水;30 min,50%乙腈水;40 min,25%乙腈水,柱温箱温度40℃,流速1 mL/min,ELSD撞击器关,漂移管温度90℃,载气流量2.5 L/min(空气)。该方法对果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的检测限分别是30、80、100、100、100、100 ng之间,回收率分别是98.4%、91.7%、95.6%、93.6%、98.2%、98.7%,精密度RSD为0.31%,精确度是95%。
　　(4)分离鉴定了与黑蒜成熟度有关的物质5-HMF,在70℃、80℃、90℃三个温度下其生成规律符合一级反应,其阿累尼乌斯方程式是ln K=-3862.5(1/T)+7.98。其表观活化能为32.11 kJ mol-1。
　　(5)黑蒜加工过程中,蔗糖在低温下呈增加的趋势而高温条件下呈减少的趋势,果聚糖在低温条件下基本不变,高温条件下逐渐减少;通过冷冻处理的大蒜可以更快得到黑蒜成品;紫蒜中的果聚糖含量要高于白蒜;热解作用所致的果糖生成量要高于果糖参加美拉德反应等的降解量,造成黑蒜产品含有大量的果糖(可高达200 mg/g)。冻白蒜,紫蒜和白蒜形成果糖的阿累尼乌斯方程分别是:ln K=-2887.1x+3.87;ln K=-24186x+64.25;ln K=-5914.6 x+12.09。其表观活化能分别是24、201.08和49.17 kJ mol-1。

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1 绪论

1.1 大蒜

1.2 黑蒜

1.3 果聚糖

1.4 低聚果糖

1.5 5-羟甲基糠醛（5-HMF）

1.6 果聚糖的合成与降解

1.7 果聚糖代谢酶的研究现状

1.8 果聚糖代谢酶的纯化手段

1.9 研究意义

2 材料与方法

2.1 技术路线

2.2试剂、材料和仪器

2.3 主要缓冲液的配制

2.4 蛋白质聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）所用溶液的配制

2.5 银染所用溶液的配制

2.6 处理方法

3 结果与分析

3.1 TLC检测六种糖

3.2 HPLC-ELSD测定六种糖

3.3 大蒜中果聚糖代谢酶类

3.4 大蒜1-FEH的分离纯化

3.5 大蒜果聚糖合成酶的粗分离纯化

3.6 黑蒜加工过程中5-HMF的分离鉴定及其生成动力学

3.7 黑蒜加工过程中果聚糖的变化规律

3.8 黑蒜加工过程中单双糖的变化规律

4 讨论

4.1 选择评价酶活性的适宜方法

4.2 1-SST的鉴定

4.3 多种果聚糖代谢酶可能共同存在于硫酸铵沉淀粗酶液中

4.4 1-FEH的鉴定方法

4.5 不同黑蒜加工方式的不同对其品质的影响

5 结论

参考文献

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致谢