SPSB2蛋白抑制肽的结构生物学研究及SPSB3靶蛋白鉴定

摘要

目的：SPSB蛋白家族的4个成员（SPSB1,2,3,4）都含有SPRY结构域和SOCS盒。SPSB1、SPSB2和SPSB4通过SPRY结构域与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）结合，从而介导iNOS的泛素化与蛋白酶体降解。抑制SPSB2与iNOS的结合，可以增加一氧化氮(NO)产生，可能可以促进杀灭病原微生物或癌细胞。本论文研究SPSB蛋白调控iNOS的结构基础，并设计干扰SPSB-iNOS相互作用的抑制肽，研究抑制肽与SPSB2的相互作用以及复合物的结构。本研究还对目前仍然未知的SPSB3蛋白的细胞内靶蛋白进行探索。 方法：本研究使用核磁共振(NMR)波谱和等温滴定量热法(ITC)，分析SPSB2蛋白SPRY结构域与iNOS氨基端短肽K9以及与设计的环八肽抑制肽cR8的相互作用。使用X-射线晶体衍射方法测定SPSB2-K9及SPSB2-cR8复合物结构。通过外源性过表达和细胞穿透肽两种方法研究iNOS氨基端短肽对RAW264.7细胞NO产生水平的影响。此外，在293T细胞和A549细胞中过表达全长以及去除SOCS盒的SPSB3蛋白，通过免疫共沉淀和质谱分析鉴定SPSB3的相互作用蛋白。 结果：NMR分析表明cR8与SPSB2蛋白SPRY结构域的iNOS结合位点结合。ITC法测得K9与SPSB2的亲和力为10+1nM；cR8与SPSB2的亲和力为699+104nM。本研究解析了SPSB2蛋白SPRY结构域与K9及与cR8复合物的晶体结构。细胞实验表明，外源性iNOS氨基端短肽可以增加RAW264.7细胞NO的产生。通过免疫共沉淀和质谱鉴定得到一些可能的SPSB3相互作用蛋白。 结论：SPSB2-K9及SPSB2-cR8复合物晶体结构的解析，为深入了解SPSB蛋白对iNOS的调控以及设计抑制剂分子提供了结构基础。本研究还初步鉴定得到一些SPSB3蛋白相互作用蛋白，为进一步研究SPSB3的细胞内靶蛋白及生物学功能奠定了基础。

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