拟南芥FLU及其与调控靶蛋白GluTR的结构生物学研究

摘要

在植物、藻类以及大多数细菌中，四吡咯的生物合成为生物有机体提供了包括叶绿素、血红素在内的重要的辅因子和色素。四吡咯的生物合成由GluTR通过heme进行调控，GluTR是四吡咯合成的关键限速酶，而在黑暗条件下FLU通过负调控抑制GluTR的活性，并与GluTR相互作用。
　　本文通过原核表达与Ni-NTA亲和层析以及分子筛层析，分别纯化得到纯度较高的FLU和FLU-GluTR复合物蛋白，经过晶体筛选和优化获得了它们的晶体，并通过分子置换法成功解析了FLU，最后获得分辨率为1.45(A)的数据。FLU与GluTR复合物晶体以FLU的TPR结构作为搜索模型，最后获得了分辨率为2.4(A)的数据。FLU晶体结构显示其由三个非典型的TPR结构域组成，并由TPR3形成二聚体，证实了TPR作为一个功能单位的假设。TPR2上的Ala262是TPR上少数几个非常保守的氨基酸之一，发生突变将产生拟南芥致死型。FLU-GluTR复合物晶体结构显示FLU与GluTR蛋白以2∶2的比例结合，FLU通过TPR结构域上的TPR1和TPR3与GluTR的C端相互作用，这种相互作用是通过它们之间的5个盐桥和1个氢键的形成发生的。通过ITC实验验证了FLU-GluTR相互作用的主要氨基酸。高等植物中GluTR的C端是非常重要的，其结构完整性是GluTR与FLU相互作用的基础。FLU与GluTR在体外可以形成稳定复合物，缺失C端15个氨基酸的GluTR可以形成二体，并仍能与FLU相互作用。体外活性实验表明，FLU与GluTR的相互作用对GluTR的活性具有显著的抑制作用，并与GluBP形成拮抗作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 拟南芥谷氨酰-tRNA还原酶

1．1．1 谷氨酰-tRNA还原酶的研究进展

1．2 拟南芥FLU蛋白

1．3 蛋白质晶体学

1．3．1 蛋白质结晶原理

1．3．2 蛋白质晶体生长的影响因素

1．3．3 蛋白质结晶方法

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和载体

2．1．2 实验主要试剂

2．1．3 试剂配制

2．1．4 实验主要仪器

2．2 基因克隆与载体构建

2．2．1 基因克隆

2．2．2 载体构建

2．3 蛋白表达与纯化

2．3．1 蛋白小量表达

2．3．2 蛋白大量表达纯化

2．3．3 亲和层析

2．3．4 分子筛层析

2．4 蛋白晶体生长条件的初筛与优化

2．4．1 晶体筛选

2．4．2 晶体优化

2．5 数据收集与结构解析

2．6 ITC实验

2．7 GluTR酶活性测定

2．7．1 GluTR酶活测定的原理

2．7．2 GluTR酶活标准曲线的绘制

2．7．3 GluTR酶活测定

第三章 FLU及FLU-GluTR复合物的晶体生长与结构解析

3．1 FLU蛋白的晶体生长与结构解析

3．1．1 FLU的序列分析

3．1．3 FLU截短体蛋白的表达与纯化

3．1．4 FLU截短体的晶体筛选与优化

3．1．5 FLUs3晶体的数据收集与结构解析

3．1．6 FLUs3的整体结构

3．2 FLU与GluTR复合物的晶体生长与结构解析

3．2．1 GluTR的序列分析

3．2．2 GluTR的PCR扩增及表达载体构建

3．2．3 FLU与GluTR复合物的表达纯化

3．2．4 FLU-GluTR复合物的晶体筛选与优化

3．2．5 FLU-GluTR复合物的数据收集及结构解析

3．2．6 FLU-GluTR复合物的整体结构

第四章 FLU和GluTR及其相互作用的研究

4．1 截短与突变对GluTR及其与FLU结合的影响

4．1．1 GluTRC端15个氨基酸对其二体形成的影响

4．1．2 GluTR C端15个残基对其与FLU结合的影响

4．1．3 GluTR单点突变对其二体形成的影响

4．1．4 GluTR单点突变对其与FLU结合的影响

4．2 突变对FLU二体形成及其与GluTR相互作用的影响

4．2．1 单点突变对FLU二体形成的影响

4．2．2 FLU单点突变对其与GluTR结合的影响

4．2．3 突变对FLU与GluTR相互作用的影响

4．3 FLU对GluTR的活性抑制实验

第五章 小结

5．1 本研究取得的结果

5．2 本研究的创新性

5．3 展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的论文