多囊卵巢综合症患者临床特征与nc RNA相关基因SNPs的相关性研究

摘要

目的： 1．收集PCOS患者临床基本信息以及辅助检查等数据资料，描述PCOS的临床基本特征，分层对照分析各种临床特征的意义及相关性；为PCOS不同临床特征的遗传易感性研究提供临床基础。 2．采用生物信息学方法筛选出IRS2、CDKN1A基因并进行其miRNAs靶结合区域内不同位点的单核苷酸测序；结合PCOS患者各种临床特征，探讨相关靶基因结合位点的SNPs与PCOS病变的相关性，探讨PCOS可能的发病因素。 3.采用生物信息学方法筛选AR-CTBP1-AS、SRA1、H19基因，并进行相关基因lncRNA结合区域内相应位点的单核苷酸测序，探讨不同位点的SNPs与PCOS各种临床特征的相关性，从表观遗传学角度探讨PCOS的可能发病机制。 4.探讨上述位点的SNPs与复发性流产的相关性，从表观遗传学角度探讨PCOS发生复发性流产的遗传易感性。 材料与方法： 1.采用病例对照研究设计，选取Rotterdam标准诊断的PCOS患者301例和正常对照女性144例为研究对象；在PCOS病例中，包括55例已生育（或已孕）无流产史的PCOS患者和60例伴发复发性流产的PCOS患者。 2.采用问卷调查方法收集调查对象基本信息，对其临床特征及进行分层对照分析，比较不同分组和正常对照间临床表现的差异及各种临床特征间的相关性。 3.相关的基因确认及单核苷酸多态性位点的筛选：采用生物信息学方法，综合利用计算、实验、流行病学资料及全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWAS）的结果和ID的信息，进一步研究遗传图谱，用HGNC、UCSC数据库和单核苷酸多态性位点功能预测数据库(SNP FunctionPrediction、F-SNP)对选定的基因和单核苷酸多态性位点进行功能预测，确认目标基因的功能，筛选出潜在功能性单核苷酸多态性位点。 4.通过人类基因组芯片进行基因型检测；提取基因组DNA，采用高通量测序法进行基因组测序。 5.分层分析miR-135a、miR-93靶基因IRS-2、CDKN1A结合区单核苷酸多态性与PCOS不同临床特征的相关性。 6.分层分析lncRNA靶基因CTBP1-AS、SRA1、H19基因结合区单核苷酸多态性与PCOS及不同临床特征的相关性。 7.分层分析miR-135a、miR-93靶基因IRS-2、CDKN1A结合区单核苷酸多态性、lncRNA靶基因CTBP1-AS、SRA1、H19基因结合区单核苷酸多态性与PCOS伴发复发性流产的相关 结果： 1.PCOS的肥胖、高雄激素征、胰岛素抵抗和多囊卵巢等临床特征的相关性分析：对照组和PCOS组在月经周期、体重指数（Body mass index，BMI）、黄体生成素（Luteinizing hormone,LH）和睾酮（Testosterone，T）的均值有显著差异（P=0.000）；在单一临床特征的分层比较中，肥胖与月经周期和胰岛素抵抗有显著相关（P＜0.05）；高雄激素症和胰岛素抵抗与月经周期、BMI、LH、LH/FSH（卵泡刺激素，Follicle-stimulating hormone）、T和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）等项目有显著相关（P＜0.05）；胰岛素抵抗与月经周期、肥胖和多囊卵巢（polycystic ovary，PCO）相关（P＜0.05）。 2.将高雄激素血症、胰岛素抵抗和肥胖进行交互关联分析，对月经周期、肥胖和BMI等影响因素进行logistic回归分析，显示在未校正年龄和BMI影响的情况下，高雄激素血症、胰岛素抵抗、高雄激素血症+胰岛素抵抗、胰岛素抵抗+肥胖及高雄激素血症+胰岛素抵抗+肥胖均可成为PCOS的主要影响因素（P=0.000，P=0.001）；在校正年龄和BMI的影响因素后，仅高雄激素血症为PCOS的主要影响因素（P=0.000）。 3.MiRNA相关两个靶基因共筛选了7个单核苷酸多态位点，其中rs2289046和rs1865434位于IRS2基因；rs1059234、rs3176366、rs3176337、rs3176359和rs74801436位于CDKN1A基因。 4.IRS2基因2个单核苷酸多态性位点rs2289046和rs1865434的三种基因型分布频率在多囊卵巢组和非多囊卵巢组有显著差异（P＜0.05）；rs2289046位点在多囊卵巢组和非多囊卵巢组的单基因频率分布有显著差异（P＜0.05）；rs1865434位点的三种基因型分布频率在肥胖组和非肥胖组有显著差异（P＜0.05）；miRNA IRS2rs2289046单核苷酸多态性与多囊卵巢有相关性（P＜0.05）。CDKN1A基因2个单核苷酸多态性位点的三种因型和两种等位基因频率分布在对照组和PCOS组比较以及分层比较中的均未发现有显著差异（P＞0.05）。 5.LncRNA相关三个靶基因共筛选了8个单核苷酸多态位点，包括AR-CTBP1-AS3个单核苷酸多态性位点：rs1680057(rs900019,rs884421,rs1250115)；rs1250109(rs1250114,rs1250111)；rs4974574；SRA4个单核苷酸多态性位点：rs801458；rs917302；rs17118938；rs4912725；LncRNAH191个单核苷酸多态性位点：rs7103849。 6.筛选出lncRNA AR-CTBP1-AS基因结合区rs1250109位点、lnc RNA SRA rs4912725、lncRNA H19rs7103849位点的单核苷酸多态性与高雄激素症、胰岛素抵抗和多囊卵巢的发生相关（P＜0.05），可能参与PCOS疾病的发生。尤其是lncRNAH19rs7103849单核苷酸多态性可能是PCOS遗传因素的重要途径之一。 7.PCOS伴复发性流产的原因可能与胰岛素抵抗、高LH血症、高雄激素血症和外周血NK细胞、T、B细胞以及Th1细胞因子无明显相关（P＞0.05）。 8.H19基因rs7103849位点A/G两种单基因频率分布在PCOS+复发性流产组、PCOS组和对照组发现有显著差异（P＜0.05）。 结论： 1.高雄激素症（包括高雄激素血症和高雄激素体征）是早期预示PCOS的独立危险因素，与胰岛素抵抗、多囊卵巢和肥胖等临床特征密切相关。各临床特征间通过不同的病理生理机制产生交互作用。 2.MiRNA IRS2rs2289046单核苷酸多态性与多囊卵巢的发生相关；miRNA IRS2rs1865434单核苷酸多态性与肥胖和多囊卵巢相关；暂未发现CDKN1A基因miRNA靶结合区域的单核苷酸多态性位点可能与PCOS病变的遗传易感性具有相关性。 3.LncRNAAR-CTBP1-AS基因rs1250109位点单核苷酸多态性与高雄激素症、胰岛素抵抗和多囊卵巢的发生相关，可能参与PCOS疾病的发生；lnc RNA SRA rs4912725单核苷酸多态性与多囊卵巢的发生相关；lncRNA H19基因rs7103849位点单核苷酸多态性与高雄激素症、胰岛素抵抗和多囊卵巢的发生相关，参与PCOS疾病的发生并在PCOS的遗传机制中发挥关键作用。 4.非编码RNA（miRNA和lncRNA）相关基因（IRS2、AR-CTBP1-AS、SRA和H19）结合区单核苷酸多态性与PCOS的临床特征存在相关性；PCO具有较强的遗传易感性。 5.LncRNAH19基因rs7103849位点SNPs与复发性流产的发生相关，提示PCOS发生复发性流产可能具有遗传易感性。

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