川芎嗪衍生物TBN在大鼠缺血性脑卒中模型中的神经再生作用及其机理研究

摘要

目的: 本实验在SD大鼠缺血再灌注脑卒中模型中研究TBN神经再生作用及其可能的作用机理。 方法： 1.在SD大鼠栓线法t-MCAo模型中，采用疲劳式转棒仪、纸条粘附实验、神经损伤性评分以及旷场实验评价t-MCAo大鼠的运动与感觉功能变化；采用Y迷宫和新物体识别观测大鼠的学习记忆；在脑组织冠状切片中采用切片免疫荧光染色观察大鼠缺血损伤附近区域新生神经元数目以及缺血侧脑室下区的新生神经祖细胞数目； 2.采用免疫荧光染色观察大鼠缺血损伤附近区域的新生少突胶质细胞数目；采用Western blot检测缺血损伤附近区域髓鞘相关蛋白MBP表达、突触标记蛋白SYP、PSD95的表达以及Akt/CREB/BDNF信号通路相关蛋白的表达； 3.在体外培养的原代皮层神经元中，采用免疫荧光染色法检测TBN对细胞神经突增长的作用；采用免疫荧光染色法检测TBN对细胞极化的作用；在神经突增长模型中，采用Western blot检测神经细胞Akt/CREB/BDNF信号通路及相关蛋白的表达情况。 4.在抗霉素A诱导线粒体氧化呼吸链损伤模型中，采用荧光探针检测TBN对自由基清除和对线粒体膜电位保护的作用；在过氧化氢诱导线粒体氧化损伤模型中，采用荧光探针检测TBN对谷胱甘肽的保护作用；在氯化钙诱导的线粒体肿胀模型中，检测TBN对线粒体膜通透性孔（MPTP）的作用；在羟基体系诱导线粒体膜脂质过氧化模型组，检测TBN对MDA生产的作用。 结果： 1.在大鼠行为学研究结果显示，与模型组大鼠相比，在手术造模后28d，TBN组大鼠的在棒时间延长、移除纸条时间减少、神经损伤性评分改善、旷场中移动距离增加；TBN组大鼠在Y迷宫中新异臂停留时间延长；在新物体识别实验中，TBN显著提升大鼠辨别指数。 2.大鼠脑组织病理学及免疫组化研究结果显示：TBN组大鼠脑皮层指数和脑湿重均显著高于模型组大鼠。脑组织切片免疫荧光染色发现，TBN组大鼠在缺血侧脑室下区新生的神经祖细胞数目显著高于模型组，在缺血侧损伤区域附近新生的未成熟神经元数目以及成熟神经元细胞数目均显著高于模型组； 3.大鼠脑组织分子生物学研究结果显示:与模型组大鼠相比，在手术造模后第28d，TBN组大鼠在缺血侧损伤区域附近新生的成熟少突胶质细胞数目增加，CNPase蛋白表达上升，髓鞘组成蛋白MBP表达上升；突触标记蛋白PSD95、SYP的表达上升；缺血侧损伤区域中，Akt/CREB/BDNF通路相关蛋白被激活； 4.在体外原代皮层神经元神经突生长模型中:TBN能显著促进神经突的增长和分叉，促进细胞p-Akt、BDNF、PSD95以及SYP的表达，在加入Akt抑制剂LY294002和BDNF受体TrkB的拮抗剂ANA-12后，TBN的促进作用被抑制且相关蛋白表达降低；在原代皮层神经元细胞极化模型中，TBN能促进神经元的极化，在加入LY294002或ANA-12后，TBN的促极化作用被抑制; 5.在体外大鼠皮层线粒体模型中：TBN能显著降低由抗霉素A诱导的线粒体内ROS水平以及保护线粒体膜电位的稳态；TBN能显著提升在过氧化氢诱导线粒体氧化损伤模型中内谷胱甘肽含量；在线粒体肿胀模型中，TBN能抑制线粒体MPT孔的开放，抑制钙离子内流；在羟基体系诱导线粒体膜的损伤模型中，TBN能显著抑制线粒体膜脂质过氧化水平。 结论： TBN通过激活Akt/CREB/BDNF信号调控通路和保护线粒体的作用，促进缺血性脑卒中大鼠神经元再生，从而改善大鼠感觉运动、学习记忆功能。

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第一章 文献综述

1 缺血性脑卒中

1.1 脑卒中概况

1.2 缺血性脑卒中发病原因及病理变化

1.3 缺血性脑卒中的治疗策略

2神经再生

2.1 神经再生定义

2.3神经再生影响因素

2.4 神经再生相关调控机制

2.5 神经再生治疗进展

3 立题依据

3.1 TMP背景

3.2 TBN成药性研究

3.3 TBN前期研究背景

3.4 课题设计

第二章 TBN在大鼠缺血性脑卒中模型中神经再生的作用研究

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 实验仪器设备

1.3 实验试剂

1.4 物与溶剂配制

2. 实验方法

2.1建立大鼠缺血再灌注脑卒中模型

2.2动物分组及给药情况：

2.3 实验大鼠体重、脑血流的变化

2.4 造模后相关行为学检测

2.5 脑组织取材

2.6 组织免疫荧光染色

2.7 苏木素伊红染色

2.8统计分析

3实验结果

3.1 大鼠的分组和死亡率情况

3.2 TBN对大鼠脑卒中后体重变化的影响

3.3各组大鼠造模前后脑血流量的变化

3.4 TBN对大鼠脑卒中后行为学的影响

3.6 TBN对大鼠脑卒中后脑湿重和皮层指数的影响

3.7 TBN对大鼠脑卒中后成熟神经元再生的影响

3.8 TBN对大鼠脑卒中后未成熟神经元再生的影响

3.9 TBN对大鼠脑卒中后神经祖细胞增殖的影响

4. 实验小结和讨论

4.1 实验小结

4.2 实验讨论

1 实验材料和实验仪器

1.1 实验动物

1.2 实验仪器与耗材

1.3 实验试剂

1.4 药物及主要溶液配制

2. 实验方法

2.1原代皮层神经元细胞提取及培养

2.2 原代皮层神经元纯度鉴定

2.3 神经突生长实验

2.4 神经元极化实验

2.5 蛋白提取

2.6蛋白定量BCA法

2.7凝胶电泳方法

2.8 组织免疫荧光染色

2.9 相关蛋白检测

2.10 统计分析

3 实验结果

3.1 TBN对大鼠缺血脑卒中后少突胶质细胞再生的影响

3.2 TBN对大鼠脑卒中后CNPase和MBP蛋白表达的影响

3.3 TBN对大鼠缺血脑卒中后突触形成的影响

3.4 TBN对大鼠脑卒中后Akt/CREB/BDNF信号通路的影响

3.5 TBN对大鼠脑卒中后Cdk5、Vimentin、MEF2D的影响

3.6 TBN对原代皮层神经元神经突生长的影响

3.7 TBN对原代皮层神经元极化的影响

3.8 TBN对原代皮层神经元Akt/BDNF信号通路的影响

3.9 TBN对原代皮层神经元SYP和PSD95蛋白表达的影响

4实验小结与讨论

4.1 实验小结

4.2 实验讨论

第四章 TBN对线粒体保护作用

1 实验材料和实验仪器

1.1 实验动物

1.2 实验仪器与耗材

1.3 实验试剂

1.4 药物及主要溶液配制

2 实验方法

2.1 脑组织线粒体提取分离

2.2 线粒体纯度检测

2.3 线粒体膜电位?Ψm检测

2.4 线粒体总氧化应激水平检测

2.5 线粒体膜肿胀水平检测

2.6 线粒体内还原性谷胱甘肽水平检测

2.7 线粒体膜脂质过氧化水平检测

2.8 统计分析

3. 实验结果

3.1 TBN抑制抗霉素A诱导大鼠皮层线粒体膜电位去极化损伤

3.2 TBN抑制抗霉素A诱导的大鼠皮层线粒体内ROS的产生

3.3 TBN抑制CaCl2诱导的大鼠皮层线粒体肿胀

3.4 TBN抑制t-BHP诱导的线粒体内还原性谷胱甘肽降低

3.5 TBN抑制自由基诱导的大鼠皮层线粒体脂质过氧化

4实验小结与讨论

4.1 实验小结

4.2 实验讨论

第五章 实验总结和展望

1 实验总结

2 课题创新点

3 实验展望

已发表文章

参考文献

致 谢