紫心甘薯二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆与功能分析

摘要

紫心甘薯（purple-fleshed sweet potato）是栽培甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]中一个具有独特遗传性状和经济价值的特色品种类型，因块肉呈深紫色而得名。紫心甘薯色素的主要成分是花青素和甲基花青素形成糖苷后的酰基化衍生物。本研究针对紫心甘薯在应用上的巨大潜力和理论研究中试材的独特性，以花青素合成途径的相关酶基因DFR基因作为研究对象，并对它的结构、进化、表达和功能进行了研究，为开展紫心甘薯花青素合成的分子机理及分子育种研究奠定基础。
　　 二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花色素苷生物合成途径中的一个重要酶，催化不同二羟黄酮醇还原酶底物生成无色花青素、无色花葵素或无色翠雀素，是一个重要的调控点。
　　 利用RACE技术克隆得到了具有完整编码框的紫心甘薯DFR基因（IbDFR），并利用生物信息学方法对其基因结构及系统进化地位进行分析。该cDNA的阅读框编码395个氨基酸，在N端存在一个NADP结合位点“VTGAAGFIGSWINMTLLQRG”及一个决定底物结合特异性的氨基酸基序“TVKRLVFTSSAGTLNVQPQQK”。系统进化分析表明它属于二氢黄酮醇4-还原酶家族的成员，与茄科的矮牵牛同属一分支。构建IbDFR基因系统进化树，体现了部分单子叶与双子叶植物间的亲缘关系与进化差异。
　　 为了了解IbDFR基因的表达模式，利用荧光定量PCR的方法考察了其在紫心甘薯品种‘山川紫’不同组织器官以及不同紫心甘薯品种或品系块根中的表达情况。结果表明，在紫心甘薯品种‘山川紫’各组织器官中均检测到IbDFR的表达，且在块根中表达量最大；不同品种或品系甘薯块根中IbDFR基因的表达水平与其花青素含量呈正相关。将获得的IbDFR基因连接到pPROEX Hta表达载体，IPTG诱导其表达，获得了重组蛋白DFR，免疫家兔获得了特异性多克隆抗血清。Western blot分析表明，不同品种或品系甘薯块根中DFR蛋白含量与其花青素含量呈正相关。
　　 为了验证IbDFR的生物学功能，将IbDFR定向插入植物表达载体pBI121，并将其导入拟南芥DFR基因缺失突变体（tt3）中。观察结果表明，从紫心甘薯块根中克隆得到的IbDFR基因在拟南芥突变株中可有效地表达，产生了基因互补的作用，使拟南芥DFR基因缺失突变株种子种皮的颜色恢复到与野生型相近的表型。从而证实了从甘薯块根中克隆得到的DFR基因是具有编码DFR酶蛋白活性的完整基因序列。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 文献综述

1.1.1 植物类黄酮概述

1.1.2 紫心甘薯

1.1.3 花色素苷生物合成途径

1.1.4 花色素苷合成途径相关酶及基因的表达

1.1.5 花色素苷合成途径的调节基因

1.1.6 DFR基因的结构与功能研究进展

1.2 引言

1.2.1 研究目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株及质粒

2.1.3 试剂和试剂盒

2.1.4 培养基和溶液的配制

2.1.5 采用的引物对

2.2 实验方法

2.2.1 紫心甘薯总RNA的提取

2.2.2 cDNA第一链的合成

2.2.3 IbDFR基因核心片段的克隆

2.2.4 紫心甘薯RACE-Ready cDNA的合成

2.2.5 IbDFR基因的RACE克隆

2.2.6 生物信息学分析

2.2.7 IbDFR基因的Southern blot分析

2.2.8 IbDFR基因的RFLP的分析

2.2.9 花青素含量的测定

2.2.10 IbDFR基因的表达检测

2.2.11 IbDFR原核表达载体的构建

2.2.12 IbDFR蛋白多克隆抗体的制备

2.2.13 不同品种甘薯块根总蛋白提取及Western blot检测

2.2.14 IbDFR真核表达载体的构建

2.2.15 拟南芥的培养及转化

第三章 结果与分析

3.1 紫心甘薯块根总RNA的提取

3.2 IbDFR基因的克隆与序列分析

3.3 IbDFR基因拷贝数和结构的分析

3.4 IbDFR基因的RFLP的分析分析

3.5 紫心甘薯IbDFR基因的表达检测

3.6 IbDPR基因的重组蛋白体外表达分析

3.7 IbDFR重组蛋白抗体的制备及Western blot检测

3.8 IbDPR基因的遗传转化及其转基因拟南芥的筛选与检测

第四章 讨论

4.1 紫心甘薯 IbDPR基因的克隆和分析

4.2 紫心甘薯 IbDFR基因表达与花青素合成和积累的关系

第五章 结论

参考文献

致谢