基于CRISPR/Cas9系统的水稻重要基因定点编辑技术研究

摘要

水稻是全世界食用人数最多的粮食作物，随着世界人口不断增长，水稻增产和品质性状的改良日益成为育种家们关注的焦点。传统育种手段基于杂交育种，耗时长且依赖育种家经验，难以满足性状定向改良需求；物理、化学、航天诱变和生物等技术手段很难做到定点突变；转基因手段尚未得到广泛认可；传统基因定点突变技术技术过程复杂且难以广泛应用，因此，迫切需求建立安全、高效的目的基因定向改良技术流程，实现品种直接改良并提供可供育种利用的新种质。近年来，以CRISPR/Cas9技术为代表的基因组定点编辑技术成为植物育种技术的研究新热点，这为水稻种质资源创新提供了安全、高效的新途径。CRISPR/Cas9技术只需设计一段与靶点配对的含20个碱基的核苷酸序列，操作简单，实验周期短，费用低，目前该技术已广泛应用于微生物和动植物的基因编辑中，但目前CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑上的研究和应用还不够。
　　本研究利用CRISPR/Cas9技术定点编辑控制水稻千粒重基因TGW6和水稻垩白性状基因 Chalk5，初步建立了基于 CRISPR/Cas9系统的水稻基因定点编辑技术平台，建立了稳定可靠的水稻农艺性状关键基因突变方法技术体系，并创制了一些具有重要价值的非转基因水稻新种质和供水稻基础研究的突变体，为重大水稻新品种的培育和基础研究奠定基础，具有重要的理论和实践意义。主要研究成果如下：
　　（1）成功构建四靶点pLY CRISPR/Cas9-TGW6、pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-1和pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-2双元表达载体，通过农杆菌介导水稻成熟胚遗传转化，成功获得一定数量的水稻H447、S95B和02428组培苗T0代。
　　（2）组培苗T0代打靶效果检测，同个靶点在不同水稻和不同基因中突变效率并不十分一致，差别较大，且四靶点并不全部发生突变，统计显示 T2靶点突变率最高。基因DNA序列突变类型主要有碱基缺失、错配和插入，其中以碱基缺失和错配为主。
　　（3）将pLY CRISPR/Cas9-TGW6载体转入籼稻S95B、pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-1载体转入籼稻S95B与H447和pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-2载体转入粳稻02428当中，成功获得组培苗，分别获得转基因T0代阳性植株为18、13、8和10株，其中发生突变植株分别有18、13、7和9株突变，突变率87.5-100％，发生双等位突变分别有6、4、4和5株，纯合突变分别有11、9、3和4株，杂合突变1株。
　　（4）对四个突变体株系进行相应表型鉴定，结果显示突变后代突变效果差异较大，相同基因系列发生突变后并没有出现一致性的改变。转pLY CRISPR/Cas9-TGW6载体籼稻S95B突变体植株千粒重表型鉴定显示较对照变化不大，只有1株千粒重22.78g大于对照7.09%，其它均低于对照组。转pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-1载体S95B和H447，垩白性状鉴定结果表明，其垩白度基本表现为高于对照组，H447阳性株系垩白度最高达到19.44%，明显高于垩白度1.96%的对照组，S95B阳性株系垩白度最高达到28.91%，明显高于垩白度2.80%的对照组。转pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-2载体02428突变植株，垩白度性状基本表现为低于对照组，阳性株系垩白度最低达到61.29%，明显低于垩白度84.00%对照组。
　　（5）初步建立了一整套基于CRISPR/Cas9系统定点编辑水稻基因的技术体系，规范和完善了水稻突变体基因鉴定和表型鉴定技术流程，初步建立了基于CRISPR/Cas9系统定点编辑水稻基因的技术平台。

目录

声明

中文摘要

英文摘要

缩略词及中英文对照

目录

1 文献综述

1.1 传统基因诱变方法

1.2 基因编辑常用方法

1.3 目的基因研究背景

1.4 本研究的目的和意义

1.5 论文研究技术路线

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验仪器和试剂

2.3 方法

3 结果

3.1载体的构建

3.2 农杆菌介导遗传转化

3.3转基因苗的筛选

3.4 CRISPR/Cas9 系统的定点突变效果检测

4讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

4.3后续研究展望

致谢

参考文献

附表A：图版

附录B：引物和样品配方

附录C：载体克隆相关序列