基于CRISPR/Cas9系统的水稻基因定点编辑与遗传转化技术的研究

摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，当前，人口增加，耕地减少，环境污染，极端自然灾害频发，水稻粮食安全面临严峻挑战。传统育种技术依赖杂交育种，不能满足性状定向改良，诱变育种又难以做到定点突变。虽然在基因组水平上进行水稻基因人工改造对作物的改良具有重要意义，但一直以来，科学家都未发现有效的植物基因组编辑技术。近年来，最新发现的CRISPR/Cas9技术凭借简单和高效的特点被广泛应用于水稻等作物的基因组编辑中。传统的水稻遗传转化普遍是农杆菌介导法，通过Ti质粒将外源遗传物质整合到受体基因组中。然而，农杆菌介导法对基因型的选择性很强，籼稻相对于粳稻更难转化，且转化周期长，并且该方法需要一套复杂的人工组织培养过程，这都增大了遗传转化的困难性和复杂性。在我国，花粉管通道法和穗茎注射法都有以水稻作为遗传转化对象成功的例子。基于CRISPR/Cas9技术的花粉管通道法和穗茎注射法的遗传转化不需要外源DN A整合到基因组上便可发挥定点编辑作用，因此，外源DNA导入技术与CRISPR/Cas9技术的结合有望创造出新型的遗传转化体系。
　　本研究利用CRISPR/Cas9技术定点编辑水稻基因tms5和SBE3，重点比较农杆菌介导法、花粉管通道法和穗茎注射法遗传转化效率的差异及探讨基于该系统的外源DNA导入技术的可行性，以期在水稻中建立一套基于CRISPR/Cas9技术且不依赖农杆菌转化的遗传转化体系，结果如下：
　　1、利用Golden Gate Assembly技术，成功构建了靶向编辑水稻淀粉分支酶基因SBE3的单靶点双元敲除载体pYLC RISPR/Cas9-SBE3，还成功获得了靶向编辑温敏不育基因tms5的四靶点双元敲除载体pYLCRISPR/Cas9-tms5。
　　2、分别通过农杆菌介导法、花粉管通道法、穗茎注射法将载体pYLCRISPR/Cas9-tms5及pYLCRISPR/Cas9-SBE3导入水稻愈伤组织或水稻植株中。通过进一步的筛选鉴定，由农杆菌介导法获得10株tms5突变植株、0株SBE3突变植株，突变率分别为61.53%与0%；由花粉管通道法获得12株tms5突变植株、0株SBE3突变植株、突变率分别为6%与0%；穗茎注射法均未获得突变植株。
　　3、通过对所有突变植株的突变类型分析发现：农杆菌介导法的10株 tms5突变植株中，2株为纯合突变，突变率为20%，7株为杂合突变，突变率为70%，1株为双等位突变，突变率为10%，各靶点的突变效率为T1（61.54%）=T2（61.54%）>T3 （53.85%）>T4（15.38%）。花粉管通道法的12株tms5突变植株中，3株整合到染色体中，占25%，未整合到染色体中有9株，占75%，其中9株为杂合突变，突变率为75%，3株为双等位突变，突变率为25%，各靶点的突变效率为T2（66.67%）>T3（33.33%）>T1（11.11%）=T4（11.11%）。
　　本论文初步验证了基于CRISPR/Cas9技术的花粉管通道遗传转化法的可行性，花粉管通道法可作为一项不依赖于农杆菌的遗传转化技术运用到CRISPR/Cas9系统中。

目录

声明

缩略词及中英文对照

1前言

1. 1基因组定点编辑的研究进展

1. 2水稻遗传转化的研究进展

1. 3 目的基因研究背景

1. 4 本研究的目的和意义

2. 1实验材料

2. 2实验器材和试剂

2. 3培养基

2. 4研究方法

3结果与分析

3. 1 多靶点载体构建

3.2 农杆菌介导的水稻Cas9载体遗传转化

3.3花粉管通道法的水稻Cas9载体遗传转化

3.4穗茎注射法的水稻Cas9载体遗传转化

4. 1讨论

4. 2结论

4. 3后续研究展望

致谢

参考文献

附录A：引物

附录B：sgRNA中间载体序列