拟南芥根部氨基酸转运蛋白LHT1介导导向农药的吸收

摘要

氨基酸导向农药杀虫剂是将天然氨基酸与杀虫活性分子拼接的药物。本文采用拟南芥氨基酸转运蛋白LHT1突变体（LHT1-KO）、野生型（WT）和过表达（35S-LHT1）植株，对系列氨基酸偶合物进行根部吸收输导实验，筛选出能够被LHT1蛋白转运的药物，进一步在细胞电生理水平上证明LHT1参与介导拟南芥根部吸收转运氨基酸导向农药的过程。
　　植株水平筛选试验，筛选出根部吸收较好的药物，并在三种基因型中进行差异吸收，结果甘氨酸甲酯-氯虫苯甲酰胺（CAP-Gly-2）能被三种基因型拟南芥根部差异吸收，其中35S-LHT1总吸收量最高，达到了321.38±22.43 nmol/g，而WT根部吸收输导至茎叶的C AP-Gly-2占总吸收量最高。结果表明， LHT1参与拟南芥根部吸收C AP-G ly-2这一过程，但可能未参与C AP-Gly-2输导至茎叶。
　　氮饥饿试验中，用30μM CAP-Gly-2代替培养基的氮源。检测三种基因型拟南芥中C AP-G ly-2含量，总吸收量减少，仍有显著差异；C AP-G ly-2从根输导至茎的百分比增加，但仍没有显著差异。这一结果，进一步验证 LHT1介导拟南芥根部吸收C AP-G ly-2。
　　在吸收抑制实验中，利用LHT1的底物甘氨酸Gly、氧化磷酸化的解偶联剂CCCP和跨膜运输抑制剂对氯高汞苯磺酸pCMBS与CAP-Gly-2共培养，检测对拟南芥根部吸收 CAP-Gly-2的抑制作用。结果显示，CCCP和 pCMBS对 LHT1-KO根部吸收CAP-Gly-2没有显著抑制作用；而在WT和35S-LHT1中，CCCP和pCMBS对根部吸收均有抑制作用，最高分别为54.90%和52.17%。竞争抑制试验显示，在 LHT1-KO中没有显著抑制作用；在WT中，30μM和100μMGly对CAP-Gly-2的抑制率分别为62.76%和70.47%；在35S-LHT1中，两种浓度的Gly对CAP-Gly-2的抑制率分别为52.92%和44.78%。这一结果证明拟南芥根部吸收 CAP-Gly-2这一过程是载体介导的主动转运；C AP-G ly-2与G ly有相似的底物特性，则参与介导C AP-G ly-2的转运蛋白可能是LHT1。
　　原生质体膜片钳试验用全细胞记录模式检测LHT1-KO、35S-LHT1和WT三种基因型的根部原生质体对不同底物的亲和力。测试结果显示，CAP-Gly-1和CAP-Gly-2能与 LHT1的底物（Gly和 Glu）一样，能引起原生质体膜上相似幅度的电流；当底物是氨基酸（Gly，Glu）和CAP-Gly-1，CAP-Gly-2时，三种基因型的原生质膜产生的去极化电流幅度具有显著差异，其中35S-LHT1原生质体膜上产生的反应最大。CAP和 DMSO诱导产生极小电流，三种基因型的原生质膜产生的去极化电流幅度也没有显著差异。结果表明，CAP-Gly-1和CAP-Gly-2能引起LHT1的表达。
　　非洲爪蟾卵母细胞异源表达系统验证LH T1的功能，C AP-G ly-1和C AP-G ly-2与Gly和 Glu类似，能引起注射过 lht1-5 cRNA的爪蟾细胞产生向内电流，而 CAP和DMSO不能引起。电流电压分析，计算不同底物对LHT1的亲和力，其中CAP-Gly-1和CAP-Gly-2具有高亲和力，K0.5分别为97.18±13.35μM和93.33±15.31μM。结果证明LH T1参与了C AP-G ly-2的跨膜过程。
　　本论文通过三种基因型的吸收差异、竞争抑制、能量抑制、原生质体膜片钳和爪蟾卵母细胞电压钳等试验，直接证明了拟南芥根部吸收C AP-G ly-2是主动过程，且介导吸收过程的转运蛋白主要是LHT1。

目录

声明

主要英文缩写一览表

1前言

1. 1 氨基酸导向农药概况

1. 2 氨基酸转运蛋白概述

1. 3 电生理学

1. 4 电生理技术分类

1. 5 研究的目的以及意义

1. 6 研究内容

1. 7 本研究的实验设计与技术路线

2实验材料

2. 1 供试植物

2. 2 供试药物

2. 3 供试爪蟾

2. 4 主要试剂

2. 5 主要培养基

2. 6 主要试剂的配置

2. 7 主要仪器

2. 8 数据采集和分析软件

3 实验方法

3. 1 拟南芥材料培养

3. 2 野生型拟南芥药物吸收试验

3. 3 拟南芥氨基酸转运蛋白LHT 1表达定量分析

3. 4 拟南芥根部吸收药物时间梯度

3. 5 药物不同基因型拟南芥差异吸收

3. 6 N饥饿拟南芥药物吸收

3. 7 竞争抑制试验

3. 8 液相检测条件

3. 9 原生质体膜片钳试验

3. 10 爪蟾异源表达系统电压钳试验

4 实验结果

4. 1 野生型拟南芥筛选输导性较好的氨基酸农药

4.2 突变体和过表达拟南芥lht1-5定量表达分析

4. 3 时间梯度试验

4. 4 不同基因型拟南芥吸收试验

4. 5 N饥饿试验

4. 6 拟南芥根部吸收抑制试验

4. 7 拟南芥原生质体膜片钳试验

4. 8 爪蟾异源表达系统电压钳试验

5. 1 结论

5. 2 讨论

5. 3 有待进一步解决的问题

5. 4 本论文的创新之处

致谢

参考文献

附录：硕士期间的相关成果