猪圆环病毒2型ORF2基因重组植物乳杆菌的构建及其免疫原性分析

摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原，以导致猪群严重的免疫抑制为主要特征。同时PCV2与其他多种疾病密切相关，如猪先天性震颤、皮炎肾病综合征、猪呼吸系统疾病症候群、母猪繁殖障碍等疾病。猪圆环病毒病是由PCV2感染引起的猪一系列相关疾病的总称，是影响养猪业发展的主要问题，给全世界养猪业造成极大的经济损失。PCV2疫苗免疫是防控该病的有效手段，世界范围内对PCV2的疫苗的需求量较高。由于在细胞上PCV2的病毒增殖滴度较低，在一定程度上限制了传统的弱毒疫苗和灭活疫苗的开发利用。PCV2的ORF2基因编码病毒的衣壳蛋白（Capsid protein，Cap），是主要的免疫原性蛋白，能刺激机体产生相应的PCV2特异性的中和抗体，因此基于Cap蛋白的亚单位疫苗已经成为基因工程疫苗的研究热点。本研究旨在研制一种能有效控制PCV2的安全、新型的亚单位疫苗。
　　本研究从确诊为圆环病毒2型感染的猪病料中抽提DNA，扩增出PCV2的全基因，克隆至pMD19-T simple载体中，测序分析筛选出PCV2 b型的毒株，设计并合成一对引物，扩增PCV2b ORF2基因，将目的基因克隆至包含M6前体蛋白信号肽SP，并由超强组成型启动子SCP驱动的植物乳杆菌表达载体pSCPSP，获得重组植物乳杆菌表达载体pSCPSP-Cap，将植物乳杆菌表达载体电转化转至表达宿主LP1，通过PCR鉴定筛选出重组阳性转化子pSCPSP-Cap-LP1。以SDS-PAGE和Western blotting法检测24 h上清液中表达的蛋白；将8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分组，每组8只，分别设置灌胃组、口服组、灭活疫苗组，灌胃组和口服组用培养18 h的阳性转化子的菌体，设置不同的浓度梯度分别给小鼠灌胃和口服，免疫后14 d、28 d、42 d和56 d对实验小鼠采血，分离血清，利用PCV2 ELIS A抗体检测试剂盒检测试验小鼠血清中PCV2的抗体水平。实验结果结显示，构建的乳酸菌表达载体pSCPSP-Cap成功电转至植物乳杆菌，并筛选出阳性转化子pSCPSP-Cap-LP1；SDS-PAGE和Western blotting结果表明PCV2的Cap蛋白在植物乳杆菌LP1中成功分泌表达，表达的蛋白分子质量为28 kDa，且具有良好的反应原性，重组植物乳杆菌免疫小鼠诱导机体产生的PCV2特异性抗体（P<0.05）。空载体免疫组和空白对照组相比小鼠的精神状态和病理解剖无眼观病变，表明植物乳杆菌自身分泌的蛋白对小鼠无毒副作用。为PCV2口服疫苗的开发研究提供理论参考。

目录

声明

常用英文缩略表

1 前言

1. 1 猪圆环病毒的概论

1. 2 猪圆环病毒病的流行现状及防控

1. 3 猪圆环病毒疫苗的研究

1. 4 乳酸菌表达系统的综述

1. 5 本研究的目的和意义

2. 1 材料

2. 2 实验方法

3 结果

3.1 PCV2b毒株的分离、鉴定

3. 2 序列测定与分析

3.3 ORF2目的基因电泳检测

3. 4 重组表达载体pSCPSP-Cap的酶切鉴定和测序结果

3. 5 重组植物乳杆菌的PCR鉴定

3.6重组植物乳杆菌表达上清SDS-PAGE分析

3.7 重组植物乳杆菌表达上清Western blotting 鉴定

3.8 小鼠血清中特异性的ELISA抗体检测

3. 9粪便检测

4 讨论

4.1 PCV2 ORF2基因分析

4. 2 重组植物乳杆菌表达系统的构建

4. 3植物乳杆菌感受态的制备及转化条件的优化

4.4 PCV2 Cap 蛋白表达的分析

4. 5 重组植物乳杆菌口服疫苗的优势及小鼠免疫评价

全 文 总 结

致谢

参考文献