猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅢA、ApxⅣA蛋白表达及重组亚单位疫苗的研究

摘要

猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是影响全球养猪业的重要细菌性疾病之一，它是一种由胸膜肺炎放线杆菌引起的以肺脏纤维素性胸膜肺炎为主要病变的呼吸道传染病。该病目前在世界范围内广泛流行，给集约化养猪业造成严重的经济损失。我国当前预防该病的主要手段是接种灭活疫苗，但是由于该致病原血清型较多、毒力因子复杂等原因，该疫苗的保护效果不好。因此，开发新型、高效的疫苗已成为防控该病的热点。溶血外毒素和外膜蛋白作为APP的重要毒力因子和免疫原，在该病的感染致病过程中发挥着重要的作用。
　　本研究主要内容包括：⑴应用PCR的方法从商品化灭活疫苗中扩增Ap xⅢA和Ap xⅣA基因，并将其克隆到表达载体pET-32a中，再以 PCR、双酶切鉴定和DNA测序验证重组质粒pET-ApxⅢA、pET-ApxⅣA。将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在 IPTG作用下诱导表达，经 SDS-PAGE和 Western blot检测重组蛋白，结果显示rApxⅢA和rApxⅣA大小分别约为50和45 kD，并证明重组蛋白具有较好的反应原性。⑵在实验室前期研究的基础上，用获得的rAp xⅢA和r Ap xⅣA蛋白，制备成油佐剂免疫小鼠进行免疫实验，免疫分组如下：Ⅰ组为PBS阴性对照，Ⅱ组为商品化三价灭活疫苗阳性对照，Ⅲ组为三价灭活疫苗和白油佐剂乳化的rAp xⅠA、r Ap xⅡA、rApxⅢA、rApxⅣA和 rOMP蛋白混合疫苗，Ⅳ组为弗氏佐剂乳化的rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA、rApxⅣA和 rOMP蛋白，Ⅴ组为白油佐剂乳化的rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA、rApxⅣA和 rOMP蛋白。每组均分三次免疫，每次间隔2周，每次免疫1周后对小鼠采血，以间接 ELIS A测定小鼠血清特异性抗体变化，第三次免疫1周后对每组小鼠分别以APP1型（4.56×107cfu）进行攻毒。结果显示疫苗Ⅳ、Ⅴ组的抗体水平基本一致，高于Ⅱ组，高于Ⅰ组，疫苗Ⅳ组和V组对APP1型攻毒保护作用（4/10）相同，高于Ⅲ组（2/10）和Ⅰ组（0/10），低于Ⅱ组（5/10）。表明本研究中的亚单位疫苗对小鼠是安全的，具有较好的保护效果，且白油佐剂和弗氏佐剂配制的亚单位疫苗都能刺激小鼠产生较高的抗体水平。

目录

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英文缩略词表

1 引言

1. 1 猪传染性胸膜肺炎的研究现状

1. 2 病原学特征

1.2.1 分类地位

1.2.2 形态特征

1.2.3 培养特性

1.2.4 生化特性

1.2.5 血清型分型

1. 3 主要毒力因子

1.3.1 APP的脂多糖（ LPS）

1.3.2 APP的荚膜多糖（CPS）

1.3.3 APP的外膜蛋白（OMP）

1.3.4 溶血外毒素（Apx）

1. 4 实验室诊断方法

1.4.1 补体结合试验（CFT）

1.4.2 凝集试验

1.4.3 间接血凝试验（IHA）

1.4.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

1. 5 猪传染性胸膜肺炎的主要疫苗

1.5.1 灭活疫苗

1.5.2 弱毒疫苗

1.5.3 亚单位疫苗

1.5.4 新型疫苗

1. 6 研究目的和意义

2. 1 材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要试剂配制

2. 2 方法

2.2.1 APP ApxⅢA、ApxⅣA基因的克隆

2.2.2表达载体构建

2.2.3 重组蛋白的诱导表达、纯化及检测

2.2.4 重组蛋白的大量制备及纯化

2.2.5 疫苗制备和动物实验

3. 1 原核表达质粒的构建

3.1.1 APP Ap xⅢA、Ap xⅣA基因的克隆

3.1.2 表达质粒与目的基因的双酶切和纯化

3.1.3 重组表达质粒的菌落PCR鉴定

3.1.4 重组表达质粒的双酶切鉴定

3.1.5 基因测序和分析

3. 2 重组蛋白的鉴定

3.2.1 重组蛋白SDS-PAGE检测

3.2.2 重组蛋白诱导条件的优化

3.2.3 重组蛋白可溶性检测

3.2.4 蛋白纯化

3.2.5 Western blot检测

3.2.6 蛋白浓度测定

3. 3 动物实验

3.3.1 小鼠半数致死量试验

3.3.2 间接ELISA检测小鼠抗体水平

3.3.3 免疫小鼠的攻毒保护实验

4 讨论

5 总结

致谢

参考文献

附录A 原核表达载体pET-32a(+)图谱

附录B 目的基因序列