基于基因组改组的酱油酿造米曲霉分子育种研究

摘要

酱油是一种营养丰富、色泽和风味独特的调味品。米曲霉沪酿3.042是酱油酿造中应用最广泛的菌种，其产蛋白酶活力，特别是产中性蛋白酶活力，影响到原料中蛋白质向氨基酸的转化，是酱油生产的核心因素。目前，我国酱油酿造的原料利用率总体水平不高，这不仅极大地浪费了资源，而且也限制了酱油品质的提高。因此，通过改良菌种，提高成品曲酶活是酱油实际生产中一个永恒的课题，这类研究对生产具有很重要的意义。 本研究通过对沪酿米曲霉3.042孢子进行原生质体的制备，用紫外线-LiCl,NTG复合诱变，获得8株中性蛋白酶活力达到6000 U/g(干基)以上的突变株群，构建成后续基因组改组育种的突变文库。基于基因组改组(Genome shuffiing)多亲株、多轮改组的特点，结合原生质体双灭活的筛选方法，将8株突变高产株分组通过紫外灭活(15 w，10 cm，15 min)和热灭活(85℃，5 min)，第一轮多亲株PEG介导融合，进行基因组改组育种，然后将融合高产株同样进行第二轮多亲株。PEG介导融合，两次融合后共获得4株性蛋白酶酶活提高到7000 U/g(干基)以上的融合株，其中最高产株较原始出发菌株产中性蛋白酶活力提高76％，初步证明了基因组改组技术在米曲霉育种上的可行性。 同时建立了用于中性蛋白酶高活力诱变株快速筛选的钙黄绿素蓝-铜配合体系。在pH7.2磷酸盐缓冲体系，1×10<'-6>mol·L<'-1>钙黄绿素蓝-Cu<'2+>，0.1g·L<'-1>蛋白底物条件下可以用于蛋白酶活力测定及实时在线检测。

目录

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第一章绪论

1.1酱油酿造工业概述

1.1.1酱油历史及营养功能

1.1.2国内外酱油产业状况

1.1.3酱油产业发展趋势

1.2酱油酿造菌种

1.2.1国内外酱油酿造菌种

1.2.2沪酿3.042米曲霉

1.3工业微生物育种技术

1.3.1经典育种技术

1.3.2现代分子育种技术

1.4本课题的意义

1.5本课题的来源及研究内容

1.5.1本课题的来源

1.5.2本课题的研究内容

第二章蛋白酶活力高通量筛选模型的建立

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1荧光试剂的光谱特性研究

2.3.2钙黄绿素、钙黄绿素蓝与金属离子配合性质研究

2.3.3钙黄绿素、钙黄绿素蓝-金属离子配合物与氨基酸作用研究

2.3.4分析应用

2.4本章小结

第三章米曲霉孢子原生质体制备条件优化

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1酶解时问对原生质制备的影响

3.3.2酶类对原生质体制备的影响

3.3.3温度对原生质体制备的影响

3.3.4 pH对原生质体制备的影响

3.3.5渗透压稳定剂对原生质体制备的影响

3.4本章小结

第四章米曲霉突变库的构建

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3结果与分析

4.3.1复合诱变路线及结果

4.3.2紫外线-氯化锂诱变处理时间与致死率、正突变率的关系

4.3.3 NTG诱变处理时间、诱变剂量与致死率和正突变率的关系

4.3.4突变库高产菌株的遗传稳定性研究

4.4本章小结

第五章基因组改组育种的研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1实验材料

5.2.2实验方法

5.3结果与讨论

5.3.1 PEG浓度对融合率的影响

5.3.2作用时间对融合率的影响

5.3.3第一代融合(FⅠ)筛选结果

5.3.4第二代融合(FⅡ)结果

5.3.5高产株遗传稳定性研究

5.4本章小结

结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表的与学位论文相关的学术论文

致谢

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