大肠杆菌重组降血压肽的分离纯化研究

摘要

降血压肽(AHP)毒副作用低、降压效果明显、来源广泛,已成为目前研究的热点。 本课题组已成功构建基因工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP),并实现了重组降血压肽Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg(VLPVPR)的高效表达。本研究在此基础上探索该重组降血压肽的分离纯化工艺,并对其生物学活性进行了初步研究。主要研究内容和结果如下： 1.对重组降血压肽基因工程菌细胞采用反复冻融法和超声波破碎法分别进行了破碎研究。确定细胞破碎的最佳方法及条件为：每克湿菌体重悬于3 mL 1×PBS缓冲液,添加EDTA至终浓度2 mmol/L,溶菌酶至终浓度20000 U/mL,30℃放置30 min后超声破碎30 min,4℃12000 g离心10 min收集上清液。在此条件下,上清液中GST-AHP浓度为1.831g/L。 2.对胰蛋白酶水解工程菌表达产物制备VLPVPR进行了正交优化实验,确定最佳工艺条件为：酶解温度为37℃,pH 8.0,酶浓度为90 U/mL,酶解时间为4 h。在此条件下,酶解产物中VLPVPR浓度为211.1 mg/L,占干物质总质量的0.434％。 3.大孔吸附树脂HPD100B对VLPVPR具有较好的纯化分离能力,其最佳分离工艺条件为：上样液pH 9.8,上样量12 BV,上样流速3 mL/cm2·min,上样结束后用水和8％乙醇各洗涤4BV,流速均为1 mL/cm2·min,而后改用60％乙醇以0.25 mL/cm2·min洗脱3 BV。此工艺下VLPVPR的回收率为92.7％,纯度为28.8％,比纯化前提高了65倍。 4.VLPVPR体外对ACE具有较强的抑制活性,其IC50为4.1μmol/L。

目录

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第一章绪论

1.1高血压概述

1.1.1高血压概念与分类

1.1.2高血压的危害

1.2血管紧张素转换酶与高血压

1.2.1血管紧张素转换酶

1.2.2 ACE对血压的调节作用

1.3降血压肽的研究

1.3.1降血压肽药物及其来源

1.3.2降血压肽的制备

1.3.3降血压肽的分离纯化

1.4本研究的目的及内容

第二章工程菌细胞破碎条件优化

引言

2.1仪器与材料

2.1.1主要仪器设备

2.1.2主要试剂

2.1.3质粒和菌株

2.1.4培养基

2.1.5常用溶液配制

2.1.6实验材料

2.2分析方法

2.2.1 SDS-PAGE蛋白电泳

2.2.2蛋白质含量的测定方法

2.2.3融合蛋白浓度的确定

2.3实验方法

2.3.1酶法与反复冻融法相结合

2.3.2酶法与超声波法相结合

2.4实验结果与分析

2.4.1溶菌酶和反复冻融结合的破碎条件研究

2.4.2溶菌酶和超声波结合的破碎条件的研究

2.4.3两种方法破碎效果比较

2.5本章小结

第三章胰蛋白酶水解工程菌表达产物制备重组降血压肽条件优化

引言

3.1仪器与材料

3.1.1主要仪器设备

3.1.2主要试剂

3.1.3实验材料

3.2分析方法

3.2.1降血压多肽VLPVPR含量的测定

3.2.2酶解液中VLPVPR与干物质质量百分比计算

3.3实验方法

3.4实验结果与分析

3.4.1工程菌表达产物水解条件的确定

3.4.2酶解液中VLPVPR与干物质质量百分比计算

3.5本章小结

第四章大孔吸附树脂吸附分离VLPVPR工艺研究

引言

4.1仪器与材料

4.1.1主要仪器

4.1.2主要试剂

4.1.3大孔吸附树脂

4.1.4实验材料

4.2分析方法

4.3实验准备

4.3.1降血压多肽VLPVPR溶液的制备

4.3.2树脂预处理

4.3.3树脂柱的制备

4.4实验方法

4.4.1非流动态吸附

4.4.2非流动态解吸

4.4.3 pH值对HPD100B吸附VLPVPR的影响

4.4.4温度对HPD100B吸附VLPVPR的影响

4.4.5流动态分离实验

4.5实验结果与分析

4.5.1非流动态吸附结果与分析

4.5.2乙醇浓度对VLPVPR解吸量的影响

4.5.3 pH值对HPD100B吸附VLPVPR的影响

4.5.4温度对HPD100B吸附VLPVPR的影响

4.5.5流动态实验结果与分析

4.6本章小结

第五章VLPVPR体外降血压活性的研究

引言

5.1仪器与材料

5.1.1主要实验仪器

5.1.2主要试剂

5.1.3实验材料

5.2实验方法

5.2.1试剂的配制

5.2.2反应液的制备

5.2.3混合液及空白样品的制备

5.2.4色谱条件

5.2.5测定原理

5.2.6 ACE体外抑制活性的测定

5.3实验结果

5.3.1色谱分析

5.3.2 IC50的测定结果

5.4本章小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文情况

致 谢