热带假丝酵母木糖还原酶和木糖醇脱氢酶在酿酒酵母的表面展示

摘要

乙醇,是一种重要的原料,广泛应用于食品工业、化工和医药卫生等领域。木质纤维素已成为燃料乙醇生产中非常有前景的材料。木质纤维素的主要组分是纤维素(20％～30％),其次是半纤维素(20％～30％)和木质素(10％～25％),其中木糖是半纤维素的主要组成部分,以木糖为底物转化乙醇的研究,是乙醇途径工程研究的热点之一。酿酒酵母是工业上生产乙醇的优良菌种。但酿酒酵母不能发酵木糖,只能发酵木糖的异构体--木酮糖。本课题利用新型的酿酒酵母表面展示体系,将木糖代谢的两个关键酶--木糖还原酶和木糖醇脱氢酶展示在酿酒酵母细胞的表面,构建可以在细胞表面启动木糖代谢的酿酒酵母表面展示工程菌。主要研究结果如下： 1.利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示系统,将来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis 1779)的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的基因xy11和xy12分别嵌入带有His标签和Flag标签的酿酒酵母a-凝集素展示载体pICAS-His和pIRS,构建重组质粒pICAS-His-Ctxy11、pICAS-His-Ctxy12和pIRS-Flag-Ctxy12。 2.重组质粒pICAS-His-Ctxy11和pICAS-His-Ctxy12分别转化到酿酒酵母宿主菌酿酒酵母MT8-1,将pICAS-His-Ctxy11和pIRS-Flag-Ctxy12共转化到酿酒酵母MT8-1,通过基因组PCR检验得到整合了xy11和xy12的重组菌株MT8-1/pICAS-His-Ctxy11、MT8-1/pICAS-His-Ctxy12和MT8-1/pICAS-His-Ctxy11/pIRS-Flag-Ctxy12。通过免疫荧光实验,证实XR-His和XDH-His都已分别成功展示在酵母细胞MT8-1/pICAS-His-Ctxy11和MT8-1/pICAS-His-Ctxy12的表面,XR-His和XDH-Flag也成功地同时展示在重组酿酒酵母MT8-1/pICAS-His-Ctxy11/pIRS-Flag-Ctxy12的表面。 3.将重组酵母MT8-1/pICAS-His-Ctxy11用于葡萄糖(15g/L)和木糖(6g/L)的混合糖发酵研究,结果表明：重组酿酒酵母MT8-1/pICAS-His-Ctxy11细胞具有良好的生长和产酶特性,同时能转化木糖生产木糖醇,在培养基中2.5g/L木糖转化生成2.5g/L木糖醇,转化率达98.7％。 4.以木糖为唯一底物进行摇瓶发酵实验,初步结果显示该重组菌株可以利用木糖,而阴性对照MT8-1/pICAS1则不能。 研究表明：酿酒酵母表面展示技术应用于木糖代谢工程菌是可行的,进一步提高木糖的利用率将可能实现木糖发酵生产乙醇的工艺。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1燃料乙醇技术研究进展与前景

1.1.1背景介绍

1.1.2世界燃料乙醇研究现状

1.1.3我国燃料乙醇的发展概况

1.1.4木质纤维素生产乙醇的研究

1.2木糖燃料乙醇技术研究进展与前景

1.2.1木糖发酵是提高纤维类物质产乙醇产率的关键

1.2.2木糖发酵微生物种类

1.2.3木糖在细胞中产乙醇生产的代谢途径

1.2.4酿酒酵母发酵木糖生产乙醇的研究现状

1.3酵母表面展示系统的研究

1.3.1酿酒酵母的表面结构

1.3.2酵母表面展示系统的类型

1.3.3酵母表面展示系统的研究进展与应用

1.4本课题的研究意义与研究内容

第二章木糖代谢相关基因的克隆和酵母展示载体的构建

2.1实验材料

2.1.1质粒和菌种

2.1.2主要仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4培养基和溶液

2.2技术路线

2.3实验方法

2.3.1目的基因的获得和表达载体的构建

2.3.2目的基因的凝胶回收

2.3.3重组质粒的获得

2.3.4重组质粒中目的基因序列的测定

2.4结果与讨论

2.4.1目的基因片段的克隆

2.4.2重组质粒构建与鉴定

2.4.3重组质粒中目的基因序列测定结果与分析

本章小结

第三章木糖代谢相关基因在酿酒酵母表面的展示

3.1实验材料

3.1.1质粒和菌种

3.1.2主要仪器

3.1.3主要试剂

3.1.4培养基和溶液

3.2实验方法

3.2.1重组质粒醋酸锂法转化酿酒酵母MT8-1

3.2.2重组酿酒酵母表型的基因组PCR鉴定

3.2.3重组酿酒酵母展示酶蛋白的诱导表达

3.2.4表面展示重组酿酒酵母的免疫荧光分析

3.3结果与讨论

3.3.1载体质粒的线性化与在酿酒酵母的转化

3.3.2重组酿酒酵母目的基因PCR鉴定

3.3.3酿酒酵母展示酶蛋白的免疫荧光分析

本章小结

第四章木糖还原酶酿酒酵母细胞表面展示及其木糖醇生产的应用

4.1实验材料

4.1.1菌种

4.1.2主要仪器

4.1.3主要试剂

4.1.4培养基和溶液

4.2实验方法

4.2.1重组酿酒酵母MT8-1/pICAS-His-Ctxyl1摇瓶发酵实验

4.2.2发酵液高效液相色谱分析

4.2.3标准曲线的绘制

4.3结果与讨论

本章小结

第五章木糖代谢酶系在酿酒酵母细胞表面展示

5.1实验材料

5.1.1菌种

5.1.2主要仪器

5.1.3主要试剂

5.1.4培养基和溶液

5.2实验方法

5.2.1重组酿酒酵母MT8-1/pICAS-His-Ctxyl1/pIRS-Flag-Ctxy12摇瓶发酵实验

5.2.2发酵液气相色谱分析条件

5.3结果与讨论

本章小结

结论与展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢