腐乳发酵过程中微生物菌群变化的研究

摘要

腐乳生产过程从前期发酵到后期发酵一直到最终产品都没有进行过加热灭菌的处理,抑制各种微生物是靠汤汁中盐分和酒。环境中的微生物都会自然落到腐乳坯上,产品经常存在产气、变红、及白点物质等长期困扰的难题,至今仍没有研究证实这些质量问题的产生与那些微生物有关,因此,腐乳发酵期间微生物及生化指标的动态分析依然是腐乳发酵过程中需要解决的问题。但到目前为止,我们甚至不能完全了解发酵物中的微生物种类,没有有效、快速的方法对各种微生物进行分离鉴定,对腐乳发酵过程中各种微生物的变化及微生物与产品卫生质量、风味之间的关系等研究甚少,对它们的代谢过程的研究更为欠缺。这些品质问题的出现都与微生物的发酵有着直接或间接的关系,对发酵物中微生物的种类、代谢产物及途径等方面的研究具有重要的意义。 本论文通过分析腐乳发酵过程中各阶段的微生物结构情况,希望能摆脱微生物传统分离鉴定方法的约束,直接从基因水平上找到快速有效的微生物分离鉴定方法；此外,本课题研究希望能够将这一分析方法直接应用与发酵食品的生产监测当中。主要研究内容及结论如下： (1)针对腐乳样品中微生物细胞与腐乳的蛋白质颗粒附着紧密,难以分离的特点,选择并比较了冻融法、氯化苄法、CTAB法对样品总基因组DNA提取的效果,结果表明,氯化苄法提取总DNA具有最高的纯度和浓度,其中纯度OD260/OD280为1.81,浓度为144.0μg/ml,此外ERIC-PCR扩增结果显示,氯化苄法能够较好的保持DNA链的完整性。 (2)对ERIC-PCR在DNA扩增检测中的灵敏度,以及DNA模板浓度、退火温度对ERIC-PCR结果的影响进行了研究和探讨。结果表明此法在混合菌体系中的检出灵敏度为0.5％,同时,当ERIC-PCR体系中DNA模板添加量大于200ng/25μl时,即能够得到良好的扩增,扩增反应的最适退火温度应维持在45℃～55℃。 (3)采用16S rDNA-PCR方法分析腐乳发酵过程中各阶段的细菌种群结构,通过对腐乳样品中总DNA的提取,扩增,以及对16S rDNA扩增片段的克隆测序,分离得到了乳杆菌属、不动杆菌属、链球菌属、志贺氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、肠球菌属的菌株。不同的发酵阶段细菌种群结构发生了变化,前发酵阶段分离出的细菌多属的链球菌属,盐胚阶段分离出较多不动杆菌属菌株,盐水浸泡阶段得到的转化子组成则更为复杂,其中包括不动杆菌、球菌、志贺(氏)菌、乳杆菌。 (4)根据ERIC-PCR扩增片段的指纹图谱找到不同腐乳样品中的差异,对差异片段进行克隆和序列分析,分离鉴定导致指纹图谱差异的特征微生物,初步分析导致腐乳产生酪氨酸结晶与包括红色链孢霉(Neurospora)在内的链孢霉属以及包括蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、苏芸金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)在内的芽孢杆菌属有密切的关系。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪 论

1.1前言

1.1.1大豆食品

1.1.2大豆发酵食品

1.2传统大豆发酵食品-腐乳生产的研究发展

1.2.1中国腐乳的悠久历史与文化

1.2.2腐乳研究的发展于生产现状

1.3腐乳的生产工艺及营养和分类

1.3.1腐乳的生产类型和特点

1.4腐乳发酵

1.4.1发酵机理及生产工艺流程

1.4.2发酵过程中存在的问题

1.4.3腐乳发酵过程中微生物研究现状及存在的问题

1.5微生物多样性分析方法的进展

1.5.1传统的微生物分离鉴定

1.5.2分子生物学方法

1.6 ERIC-PCR

1.6.1 ERIC的发现与分布规律

1.6.2 ERIC的结构特征及功能

1.6.3微生物ERIC-PCR分型的建立

1.6.4 ERIC-PCR的扩增产物的形成规律

1.6.5 ERIC-PCR技术的优势

1.6.6 ERIC-PCR在菌株分类和鉴定中的应用

1.6.7 ERIC-PCR在环境微生物群落多样性分析中的应用

1.6.8 ERIC-PCR与发酵工业

1.7本课题的研究目的和主要研究内容

第二章DNA提取方法的确立

2.1引言

2.2材料与设备

2.2.1主要仪器设备

2.2.2主要试剂和耗品

2.2.3供试样品

2.2.4 ERIC-PCR引物

2.3实验方法

2.3.1样品预处理

2.3.2溶液的配制

2.3.3 DNA提取方法

2.3.4紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度

2.3.5 ERIC-PCR扩增

2.4结果与讨论

2.4.1不同方法提取总DNA样品的纯度和浓度

2.4.2不同方法提取效果的比较

2.4.3 ERIC-PCR扩增产物的多态性分析

2.5本章小结

第三章ERIC-PCR检出灵敏度及体系、程序优化

3.1引言

3.2材料与设备

3.2.1主要仪器设备

3.2.2主要试剂和耗品

3.2.3供试菌株

3.3实验方法

3.3.1供试菌株的培养

3.3.2 DH5α和JM109平板计数

3.3.3 Dh5α和JM109混合菌体系

3.3.4细菌总DNA基因组的提取

3.3.5 DNA浓度、纯度测定

3.3.6 ERIC-PCR引物序列

3.3.7 ERIC-PCR体系、程序优化

3.4结果与讨论

3.4.1 DH5α、JM109基因组DNA质量评价

3.4.2 DH5α、JM109的ERIC-PCR图谱的特征及稳定性

3.4.3混合菌体系ERIC-PCR指纹图谱的稳定性及检出灵敏度

3.4.4 DNA模板量对ERIC-PCR结果的影响

3.4.5退火温度对ERIC-PCR结果的影响

3.5本章小结

第四章腐乳发酵过程中微生物群落结构动态ERIC-PCR指纹图谱分析

4.1引言

4.2材料与设备

4.2.1主要仪器设备

4.2.2主要试剂和耗品

4.2.3供试样品

4.3实验方法

4.3.1样品预处理

4.3.2腐乳样品总基因组DNA提取

4.3.3ERIC-PCR

4.4结果与讨论

4.4.1 ERIC-PCR用于微生物群落总DNA指纹图谱分析的稳定性

4.4.2不同发酵过程微生物群落结构变化及相似性分析

4.5本章小结

4.5.1关于ERIC-PCR

4.5.2微生物种群结构变化及其与功能的相关性

第五章 16S rDNA-PCR分析腐乳发酵过程微生物组成

5.1引言

5.2材料与设备

5.2.1主要仪器设备

5.2.2主要试剂和耗品

5.2.3供试样品及菌株

5.3实验方法

5.3.1样品预处理

5.3.2腐乳样品总基因组DNA的提取

5.3.3 16s rDNA引物序列

5.3.4 16S rDNA-PCR扩增

5.3.5 QIAGEN柱式纯化试剂盒纯化16S rDNA-PCR产物

5.3.6试剂配制

5.3.7 16S rDNA片段的转化

5.3.8阳性克隆子的蓝白斑筛选

5.3.9克隆片段在表达系统内的扩增

5.3.10质粒提取

5.3.11质粒DNA片断测序

5.4结果与讨论

5.4.1三个发酵阶段腐乳样品的16s RDNA-PCR扩增结果

5.4.2重组质粒的提取及PCR分析

5.4.3重组质粒测序结果和同源性分析

5.4.4腐乳发酵各阶段微生物种群结构及变化

5.5本章小结

第六章 ERIC-PCR在腐乳品质检测中的应用

6.1引言

6.2材料与设备

6.2.1主要仪器设备

6.2.2主要试剂和耗品

6.2.3供试样品及菌株

6.3实验方法

6.3.1样品预处理

6.3.2细菌总DNA基因组的提取

6.3.3 ERIC-PCR引物序列

6.3.4 ERIC-PCR扩增

6.3.5 QIAGEN柱式琼脂糖凝胶回收试剂盒回收ERIC-PCR产物

6.3.6试剂配制

6.3.7 ERIC-PCR扩增片段的转化

6.3.8阳性克隆子的蓝白斑筛选

6.3.9克隆片段在表达系统内的扩增

6.3.10质粒提取

6.3.11质粒DNA片断测序

6.3.12腐乳样品的风味成分分析

6.4结果与讨论

6.4.1正常腐乳样品与长白点腐乳样品ERIC-PCR的电泳结果

6.4.2重组质粒的提取及PCR分析

6.4.3重组质粒测序结果

6.4.4正常腐乳样品与长白点腐乳样品的风味成分分析

6.5本章小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致 谢