工艺过程中何首乌化学成分动态变化与药效相关性研究

摘要

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，临床应用上有生首乌和制首乌之别。传统中医认为，生何首乌性平，味苦涩，微甘，具有解毒消痈，润肠通便的功效，主治凛病疮痈，风疹瘤痒，肠燥便秘；制何首乌性温，味甘，入肝，肾经，具有补肝肾，益精血，乌须发，强盘骨的功效，主治血虚萎黄，眩晕耳呜，须发早白，腰膝酸软，肢体麻木，崩漏带下，久虐体虚，高脂血症等。经常食用何首乌，对神经衰弱、白发、脱发、贫血等病症有一定的治疗作用。何首乌还有强壮神经的作用，可健脑益智，能够促进血细胞的成长和发育，有显著的抗衰老作用。经常食用何首乌，对神经衰弱、白发、脱发、贫血等病症有一定的治疗作用。何首乌还有强壮神经的作用，可健脑益智，能够促进血细胞的生长和发育，有显著的抗衰老作用。何首乌中的主要化学成分为二苯乙烯苷类、蒽醌类及磷酯类，二苯乙苷是何首乌中含量较高的一类成分，活性明确，蒽醌类成分具有降低胆固醇、降血糖、抗病毒、强心，促进胃肠蠕动等作用；卵磷脂类成分耐热性，抗菌性均较差。中药生产过程一般提取、纯化、浓缩、干燥等步骤，在这些操作过程中二苯乙烯苷类物质易在发生聚合，水解，氧化。结合蒽醌易转化为游离蒽醌，最终使何首乌药效下降甚至产生毒性。因此，有必要探明何首乌中的二苯乙烯苷类，蒽醌类，磷脂类等成分在工艺制备过程中的动态变化规律，以及化学成分的动态变化与药效之间的相关性。本文以中药何首乌饮片为研究对象，采用生产中常用的提取、纯化、浓缩、干燥等技术对何首乌饮片进行处理，制备不同工艺何首乌样品，同时优化各制备工艺的最佳参数，构建何首乌化学成分特征图谱，考察不同制备工艺过程中主要化学成分的动态变化规律。通过LC-MS-MS初步鉴定何首乌特征图谱中各化学成分。同时建立高脂血症小鼠模型，进行降血脂、抗氧化的药效学试验，获得特征图谱的量化特征和药效学数据。在此基础上，采用灰关联分析方法进行分析，寻找何首乌化学成分与降血脂、抗氧化药效之间的对应关系。
　　本研究主要内容包括：⑴选择符合药典标准的何首乌饮片，以二苯乙烯苷转移率为评价指标，优选何首乌提取、纯化、浓缩、干燥等制备工艺的最佳参数。并按各制备工艺的最佳参数制备何首乌样品。水提工艺优选结果显示：加水量和提取次数对二苯乙烯苷转移率存在显著性影响。各因素对二苯乙烯苷转移率影响大小顺序依次为：加水量>提取次数>回流时间>浸泡时间。加水量越大，提取次数越多，二苯乙烯苷的转移率越高，结合成本因素，确定其最佳工艺为：取何首乌饮片适量，加12倍量水提取两次，每次1小时。醇提工艺优选结果显示：乙醇浓度和回流时间对二苯乙烯苷转移率存在显著性差异。各因素对二苯乙烯苷转移率影响大小顺序依次为：乙醇浓度>回流时间>加醇量>提取次数。乙醇浓度越高，回流时间越长，二苯乙烯苷的转移率越高，乙醇用量和提取次数对二苯乙烯苷转移率影响不明显。根据分析结果得出何首乌最佳醇提工艺为：取何首乌药材适量，加10倍量80%乙醇，提取两次，每次1h。生物酶酶解提取结果显示：无论以哪种酶进行酶解提取，与空白对照组相比，提取液中二苯乙烯苷含量均明显下降，采用果胶酶下降最明显，加入0.4%的酶进行酶解时，二苯乙烯苷的提取效率降低了53.9％，提示此时二苯乙烯苷有较大损失，但酶的用量与二苯乙烯苷转移率结果规律性不明显。酶解提取效果不好的原因可能是加入的缓冲液使二苯乙烯苷分解，或加入的生物酶分解了何首乌的提取液中的淀粉成份，使提取液黏度增大，从而影响有效成份的溶出。从何首乌酶提实验的初步探索中可得出，对何首乌进行生物酶提取时应谨慎选择。半仿生提取结果显示：提取时间对二苯乙烯苷转移率影响最大，其次为第一次提取液pH值，第二次提取液pH值影响最小，提取时间超过2h后，提取液中二苯乙烯苷含量反而降低，所以最优提取时间为2h；何首乌在偏弱碱的环境中溶出率增加，这与何首乌中二苯乙烯苷的性质有关，二苯乙烯苷含较多的酚羟基，显弱酸性，在碱性环境中易于溶出，同时二苯乙烯苷为酚苷，在强碱中易为碱催化水解，溶出率减少。确定何首乌的最佳半仿生提取工艺为：取何首乌饮片适量，加12倍量水，加热回流提取两次，每次2h，第一煎液用稀HCl调节pH值至6，第二煎液用NaOH调节pH值至10。⑵最佳水提醇沉工艺为：取何首乌水提液，浓缩至料液比为1:2，加入80%乙醇，醇沉至醇浓度为60%。静置12h，滤过。水提醇沉操作能明显降低何首乌的出膏率，但易造成二苯乙烯苷成分损失，各实验中二苯乙烯苷的转移率普遍不高。大孔吸附树脂筛选结果显示：选用中等极性的LSA-21型树脂进行纯化，效率最高。因此，选择该型号树脂进行动态吸附实验考察，确定其最佳动态吸附工艺为：取LSA-21树脂10g，上柱，分别加入0.2g/ml（相当于生药量）何首乌上样液60ml进行动态交换吸附，吸附流速为1.0ml/min，收集流出液，待吸附完全后加水洗至流出液接近无色后，加60%乙醇60ml洗脱，调节流速1.0ml/min，收集洗脱液。验证实验证明，LSA-21树脂对何首乌二苯乙烯苷的动态吸附率、解吸率均在80%以上，纯化效果良好。纯化后二苯乙烯苷在干膏中的含量由7.3%提高至43.5%。⑶中药生产中，提取液的浓缩与干燥是必不可少的环节，但操作时往往需要加热，易造成有效成分转移率下降，本实验对何首乌的浓缩及干燥工艺分别进行了考察。根据二苯乙烯苷及结合蒽醌的转移率测定数据，将提取液于80℃时浓缩至相对密度为1.15时二苯乙烯苷，结合蒽醌转移率最高。实验过程中对浓缩液分别进行了冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥考察。结果显示，何首乌浓缩液经喷雾干燥得到的干燥品水溶性较好，但二苯乙烯苷转移率不高，加入3%β-环糊精后，转移率得到一定程度提高，原因可能是喷雾干燥操作过程温度较高，易造成二苯乙烯苷成分分解，另外，实验时采用的喷雾干燥为小型设备，许多的干燥品粘附在器壁上难以收集完全也是原因之一。冷冻干燥得到的干燥品二苯乙烯苷及结合蒽醌转移率均较高，但干燥所需时间长，且干燥品水溶性差，不适宜制成配方颗粒。⑷优选出各制备工艺的最佳参数后，分别按最佳工艺制得何首乌样品，分别为ST、CT、STCC、STSZ、STPW、CTPW、BFS、MJ、HDPZ，共计9个具有代表性的样品。相似度计算结果表明：HDPZ与STSZ组与其他各组图谱差异较大，提示这两种制备工艺中对成分产生较大影响。传统的水提，醇提等工艺则对化学成分变化影响较小。采用液相色谱-质谱（LC-MS-MS）联用技术分析了何首乌特征图谱中的化学成分，结果显示，何首乌特征图谱中主要成分包括：2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯2-O-β-D-葡萄糖苷，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷以及大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等游离蒽醌类物质。根据成分类型，何首乌特征图谱可以分为3个区域，A区主要为强极性物质，且与炮制关联较大，B区主要为二苯乙烯苷及蒽醌苷类成分，C区主要为游离蒽醌类成分。实验结果表明，何首乌各样品中，喷雾干燥和树脂纯化对2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯2-O-β-D-葡萄糖苷的转移率影响较大，提示这两种制备过程易造成成分的损失，采用大孔树脂纯化影响次之，其余几个因素影响相同。

目录

声明

引言

第一章 文献综述

第一节 何首乌研究概况

第二节 生产过程中的中药化学成分动态变化研究

第三节 中药化学成分与药效相关性研究

第四节 研究思路

第二章 不同工艺制备何首乌样品

第一节 何首乌饮片质量评价

第二节 何首乌制备工艺优选

第三节 何首乌样品的制备

第三章 不同制备工艺对何首乌特征图谱的影响

第一节 制备工艺对何首乌特征图谱相似度的影响

第二节 何首乌化学特征图谱LC－MS分析及化学成分鉴定

第四章 不同制备工艺何首乌样品化学成分的含量动态变化规律

第一节 不同制备工艺对何首乌二苯乙烯苷转移率的影响

第二节 不同制备工艺对何首乌结合蒽醌转移率的影响

第三节 不同制备工艺对何首乌其它成分转移率的影响

第四节 工艺过程中各化学成分含量动态变化规律

第五章 不同制备工艺对何首乌降血脂、抗氧化药效的影响

一、仪器与试药

二、方法与结果

三、小结

第六章 何首乌中各化学成分与药效相关性研究

第一节 灰关联统计学方法简介

第二节 何首乌化学成分与药效灰关联分析

结语及展望

一 文献综述研究

二 最佳工艺制备参数的获得

三 不同制备工艺对何首乌降血脂、抗氧化药效影响

四、不同制备工艺何首乌化学成分动态变化研究

五 何首乌化学成分与降血脂、抗氧化药效相关性研究

六 研究中的不足与展望

创新性

参考文献

缩略语

在校期间发表论文情况

致谢