转抗菌肽基因与非转基因鱼腥草的mRNA及蛋白质差异分析

摘要

目的：为分析转基因鱼腥草非预期效应及进一步评价其安全性提供信息和理论依据，并为转基因中药的安全性评价提供参考，应用mRNA差异显示逆转录聚合酶链式反应（DDRT-PCR）技术以及蛋白质双向电泳技术，分别分析转基因与非转基因鱼腥草在mRNA及蛋白质水平的差异，探讨转外源抗菌肽基因对鱼腥草转录组和蛋白质组的影响。
　　方法：⑴以相同生长条件、生长状态、生长阶段的转基因鱼腥草和非转基因鱼腥草叶片为材料，运用 mRNA DDRT-PCR技术，检测转基因与非转基因鱼腥草叶片之间的差异表达条带，对差异明显的条带进行回收，二次扩增，测序后，与 GeneBank数据库中已知基因序列进行 Blast同源搜索比对，寻找差异片段的同源基因或序列，并推测差异表达基因的功能。⑵分别采用凯基试剂盒、三氯乙酸/丙酮沉淀法、尿素/硫脲提取法及酚法4种方法提取鱼腥草叶片总蛋白，对提取的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)分析，筛选适合于鱼腥草叶片总蛋白的提取方法，建立鱼腥草叶总蛋白双向电泳体系。⑶以相同生长条件、生长状态的转基因鱼腥草和非转基因鱼腥草叶片为材料，选用适合于鱼腥草叶片总蛋白的提取方法提取鱼腥草叶片总蛋白，对所提取的蛋白样品进行双向电泳(2-DE)，2-DE凝胶图片经PDQuest软件分析，选取差异显著蛋白质点进行回收，利用质谱技术分析并与 NCBI数据库搜索比对鉴定蛋白质。根据鉴定成功的蛋白质初步分析转基因对鱼腥草生理生化可能产生的影响。
　　结果：①比较转基因与非转基因鱼腥草植株mRNA DDRT-PCR的结果表明，在转基因与非转基因鱼腥草之间检测到70条差异表达条带，经片段回收，二次PCR及测序，共获得了20个差异片段序列，通过与GeneBank数据库中已知的基因序列进行Blast同源搜索比对，发现有8条差异表达片段序列与已知基因序列具有同源序列。②通过蛋白得率、SDS-PAGE图谱和2-DE图谱筛选，结果表明，酚法和尿素/硫脲提取法提取的鱼腥草叶片总蛋白得率较高，SDS-PAGE图谱电泳条带多、清晰，2-DE图谱清晰、蛋白点多、分辨率高、图谱横竖纹少，适合于鱼腥草叶片总蛋白的制备。③转基因和非转基因鱼腥草叶片总蛋白质双向电泳的结果表明：尿素/硫脲法共得到5个表达差异明显的蛋白质点；酚法共得到8个表达差异明显的蛋白质点。回收了其中5个差异蛋白质点，经质谱分析，有4个蛋白质点被成功鉴定，鉴定成功率为80%。其中有3个差异蛋白与叶片光合作用过程有关的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶具有同源性，有1个差异蛋白与新陈代谢过程有关的半胱氨酸合成酶具有同源性。
　　结论：⑴通过分析mRNA DDRT-PCR结果发现，转基因鱼腥草的mRNA表达和非转基因鱼腥草之间存在差异，对获得的差异片段进行同源性序列比对，发现差异片段的序列与已知植物基因存在高度同源性。表明转外源抗菌肽基因对鱼腥草的mRNA产生了影响。⑵通过鱼腥草叶片总蛋白质提取方法的筛选，尿素/硫脲提取法及酚法适合于鱼腥草叶片总蛋白质的提取；并建立了鱼腥草叶片总蛋白质双向电泳体系。⑶通过双向电泳技术分析转基因与非转基因鱼腥草之间蛋白质水平差异，结果表明转外源基因对鱼腥草蛋白质组产生了影响，可为进一步分析转基因鱼腥草非预期效应以及安全性评价提供信息和理论依据。

目录

声明

引言

第一章 研究背景与立题依据

1.1 转录组研究概述

1.2 蛋白质组学研究概述

1.3 立题依据

第二章 转基因与非转基因鱼腥草叶片的DDRT-PCR分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 鱼腥草叶片总蛋白的提取方法比较

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 转基因与非转基因鱼腥草叶片总蛋白的双向电泳分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3讨论

4.4 小结

结论与展望

一、结论

二、展望

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢