外源抗菌肽对鱼腥草基因组功能影响的mRNA差异分析

摘要

目的：通过mRNA差异显示RT-PCR技术分析转基因鱼腥草和非转基因鱼腥草在转录组水平上的差异，探讨外源基因转化对鱼腥草基因组功能的影响，为转基因鱼腥草非预期效应的分析及进一步的安全性评价提供信息和依据，为转基因中药的安全性评价提供参考。
　　方法：
　　1．采用四种方法提取非转基因鱼腥草叶片总RNA，所用试剂分别为RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue、SDS（十二烷基硫酸钠）Ⅰ、SDSⅡ和CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），在匀浆液抽提时分别采用6种试剂组合：氯仿、醋酸钾+氯仿、氯化钠+氯仿、PCI（苯酚/氯仿/异戊醇）、醋酸钾+PCI、氯化钠+PCI，并通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳考察所得RNA的纯度和完整性；对CTAB法提取所得 RNA进行18S RNA的RT-PCR，反转录时分别使用 PrimeScript Reverse Transcriptase和Quantscript cDNA第一链合成试剂盒。
　　2．用 CTAB法结合 PCI抽提得到非转基因鱼腥草叶片总 RNA，分别使用PrimeScript Reverse Transcriptase和Quantscript cDNA第一链合成试剂盒对总RNA进行反转录，获得的cDNA用3个锚定引物和26个随机引物的78个引物组合进行PCR，产物分别用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，聚丙烯酰胺凝胶用银染显色。
　　3．选取生长条件、生长状态、生长阶段一致的转基因鱼腥草植株和非转基因鱼腥草植株进行mRNA差异显示RT-PCR。
　　结果：
　　1．鱼腥草总RNA的提取方法中，RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue法结合PCI+氯化钠抽提、SDSⅡ法和CTAB法结合PCI抽提所得RNA的纯度和完整性均好，其中CTAB法所得RNA的产量最高。CTAB法中6种抽提试剂组合提取得到的鱼腥草总 RNA，分别用 PrimeScript Reverse Transcriptase和 Quantscript cDNA第一链合成试剂盒反转录后，扩增18S RNA的产物经琼脂糖凝胶电泳均显现清晰条带。
　　2．非转基因鱼腥草叶片总 RNA分别用 PrimeScript Reverse Transcriptase和Quantscript cDNA第一链合成试剂盒反转录，所得cDNA的差异显示PCR结果有所不同，即同样的引物组合显现的条带有不同；mRNA差异显示RT-PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果较琼脂糖凝胶电泳的条带清晰且分明。
　　3．对转基因鱼腥草植株和非转基因鱼腥草植株进行 mRNA差异显示 RT-PCR的结果表明，用PrimeScript Reverse Transcriptase反转录的结果中共有44个差异条带，而用Quantscript cDNA第一链合成试剂盒反转录的结果中共有142个差异条带。
　　结论：
　　1．经过鱼腥草叶片总RNA提取方法的优化及18S rRNA的RT-PCR，确定CTAB法结合PCI抽提为最合适的RNA提取方法，该法所得总RNA纯度和完整性最好、产量最高，可作为有效模板反转录为cDNA，能够用于进一步的DDRT-PCR分析；RT-PCR结果也表明，反转录方法 PrimeScript Reverse Transcriptase和 Quantscript cDNA第一链合成试剂盒均能进行有效的反转录。
　　2．通过RNA提取、反转录、PCR及结果显示的方法选择，建立了鱼腥草叶片的mRNA差异显示RT-PCR体系。两种反转录方法的结果表明，反转录方法是影响mRNA差异显示RT-PCR结果的重要因素，两种方法的结果有一定差异，在分析差异条带时可互相补充；聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，银染后可获得良好的结果，且操作简便快速，清晰度和灵敏度均高于琼脂糖凝胶电泳。
　　3．通过mRNA差异显示RT-PCR结果的分析，发现转基因鱼腥草植株和非转基因鱼腥草植株之间存在mRNA的差异，由此可知外源抗菌肽对鱼腥草的基因组功能产生了影响，这种影响可能会导致蛋白的表达及代谢产物的生成发生改变，研究结果可为转基因鱼腥草非预期效应的分析及深入的安全性评价提供一定的信息和依据。

目录

声明

引言

第一章 研究背景与立题依据

1.1 转基因技术的研究

1.2 转基因植物的评价

1.3 组学技术的应用

1.4 mRNA差异显示技术的研究

1.5 立题依据

第二章 鱼腥草叶片总RNA的提取方法比较

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 鱼腥草叶片的mRNA差异显示体系的建立

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 转基因鱼腥草和非转基因鱼腥草的mRNA差异显示分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

结论与展望

一、结论

二、展望

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢