慢性HBV携带者肝细胞内HBcAg分布状态及补肾法的干预效应

摘要

背景和目的： 众所周知，慢性HBV感染有四个阶段:免疫耐受期、免疫清除期、非活动复制期和再活动期。很多学者认为，慢性HBV感染四阶段与肝细胞内HBcAg分布状态密切相关，而肝细胞内HBcAg分布又与病情轻重、病毒载量、治疗应答相关联，并影响着慢乙肝的进程和转归。目前在临床上，人们依赖病理学家的知识和经验来判断HBcAg的表达和分布，然而，由于病理切片自身的问题和主观经验的限制，常常出现主观偏倚。而且，肝细胞内HBcAg分布临床意义的研究虽然在某种程度上基本达成共识，但进一步深入探讨，存在学术分歧的地方仍然很多。分析其原因，一是如上评价方法的客观性尚有不足，二是研究者采用的评价方法并不统一，三是病例选择差异较大。此外，从中医理论看，肝细胞内HBcAg分布与前人的“伏邪”学说能否汇通和结合？中医补肾法为主是否有一定的疗效？这也是一个值得探讨的话题。 基于以上背景，本研究有4个目的:①从理论上探讨肝细胞内HBcAg分布状态引入中医伏气温病学说的可能性;②设计和验证一种较为客观的，定量的肝细胞内HBcAg分布的分层评价方法;③探讨肝细胞内HBcAg不同分布状态的临床意义（各病毒学、免疫学指标以及肝脏病理在HBcAg不同分布状态的表达情况）;④探讨补肾法治疗对肝细胞内HBcAg不同分布状态及各病毒学、免疫学指标的影响。 研究方法： 1.资料来源:来自导师领衔主持的国家重大科技专项课题“慢性乙肝病毒携带者的证候规律及中医药治疗方案研究”[20]中429例患者的病例资料。 2.切片成像与图像处理:从深圳市中医院获取免疫组化染色切片，在第三人民医院病理科进行切片拍照，判断HBcAg阳染情况，并进行图像编号、标示。应用Image-Pro-Plus图像处理软件，在HIS模式下，分别测出平均每个视野内的阳性细胞核个数、染色面积、平均光密度值，以及整个视野背景的平均光密度值。根据不同色度参数，可以得出阳性细胞浆HBcAg免疫组织化学阳性面积，亦可以分别计数HBcAg免疫组织化学阳性与阴性的细胞核。最后，分别获得HBcAg胞浆阳性面积和胞核阳性个数的数据。 3.肝细胞内HBcAg分层评价方法:通过胞浆、胞核阳染率的计算公式，统计所有病例胞浆、胞核阳染率，待统计完毕，根据胞浆、胞核阳染率数据分布特点，定量划分HBcAg表达的不同层级，并探讨HBcAg分布与一般情况及病理学、病毒学、免疫学指标的关系，从而判断其临床意义。 4.血清学指标检测:血清HBV DNA定量检测采用PCR ELISA全自动内标法（Roche公司COBAS AmpliprepTaqMan48系统），分别在治疗开始及第24周、52周各检测1次;血清乙肝标志物HBsAg、 HBsAb、HBeAg、 HBeAb、HBcAb，采用AbottLaboratories ARCHITECT i2000sr系统化学发光免疫法进行检测;血清Th1/Th2型细胞因子;IL-2、 IL-4、IL-10、IFN-γ、 TNF-α，采用ELISA方法检测。 5.“补肾法”疗效观察:“补肾法”是以补肾为主兼以健脾和清透的治疗方案。补肾健脾方由仙灵脾30g、菟丝子10g、杜仲15g、怀牛膝15g、枸杞子15g、黄芪15g、白术15g、茯苓15g、猪苓10g、枳壳10g、印度叶下珠15g、丹参20g、三七5g、郁金15g组成。补肾清透方由印度叶下珠30g、菟丝子10g、仙灵脾30g、女贞子15g、旱莲草15g、柴胡10g、白芍10g、枳实10g、桃仁10g、甘草5g、虎杖15g。均每日一剂，分两次服用。进行治疗组和对照组HBcAg分布情况及病毒学、免疫学、病理学指标的对照研究，以评价其疗效。 研究结果： 1.肝细胞内HBcAg分布特点及其临床意义 (1)429例患者HBcAg胞浆和胞核阳性分布:0-2.5％ HBcAg胞浆阳性表达的患者病例数最多，随着胞浆阳性表达升高，病例数逐渐减少，高于40％的阳性表达以个例情况为主;0-2.5％胞核阳性表达的患者病例数最多，超过总体样本40％，2.5-5.0％阳性表达病例数明显降低。 (2) HBcAg胞浆与胞核分层情况:HBcAg胞浆阳染显示，胞浆HBcAg阳染率＜0.05％设为0级，基本代表胞浆HBcAg表达阴性;0.05％＜胞浆阳染率＜5％设为1级，5％＜胞浆阳染率＜10％设为2级，10％＜胞浆阳染率＜20％设为3级，胞浆HBcAg阳染率＞20％以上者设为4级。HBcAg胞核阳染显示，胞核阳染率=0％设为0级，代表着细胞核HBcAg表达阴性;0％＜胞核阳染率＜2％设为1级，2％＜胞核阳染率＜10％设为2级，10％＜胞核阳染率＜20％设为3级，胞核阳染率＞20％设为4级。 (3)不同性别HBcAg分布表达:男性与女性无论在HBcAg胞浆还是胞核中表达的比较，均无统计学意义(P＞0.05)。 (4)不同年龄段HBcAg分布表达:HBcAg胞核的表达主要集中于25-47岁，胞浆则集中在26-47岁。 (5)血清HBsAg在HBcAg胞浆、胞核分布中表达:血清HBsAg滴度在0级HBcAg胞浆分布明显高于3级、4级（P值分别为＜0.05，＜0.01），1级、2级滴度表达皆高于4级（P值分别为＜0.05，＜0.05）。它在0级HBcAg胞核分布明显低于1、2、3、4级（P值分别为＜0.05，＜0.001，＜0.001，＜0.001），1级的表达明显低于2、3、4级(P值分别为＜0.01，＜0.05，＜0.05)。 (6)血清HBeAg在HBcAg胞浆、胞核分布中表达:血清HBeAg滴度在1级、3级HBcAg胞浆分布明显高于4级，有统计学意义（P值分别为＜0.01，＜0.05）。它在0级HBcAg胞核分布明显低于1、2、3、4级（P值分别为＜0.001，＜0.001，＜0.001，＜0.001），1级中表达低于3级(P＜0.05)。 (7)血清HBV DNA在HBcAg胞浆、胞核分布中表达:血清HBV DNA载量在HBcAg胞浆分布无统计学意义(P＞0.05)。它在0级HBcAg胞核分布明显低于1、2、3、4级（P值分别为＜0.01，＜0.001，＜0.001，＜0.001），1级低于2、3、4级(P值分别为＜0.05，＜0.01，＜0.01)。 (8) IL-2在HBcAg胞浆、胞核分布中表达: IL-2在0级HBcAg胞浆分布明显高于1、2、3、4级（P值分别为＜0.001，＜0.001，＜0.001，＜0.001），1级高于2、4级（P值分别为＜0.001，＜0.01）。它在HBcAg胞核分布无统计学意义(P＞0.05)。 (9) IL-4在HBcAg胞浆、胞核分布中表达: IL-4在0级HBcAg胞浆分布明显低于1、2、3级（P值分别为＜0.05，＜0.01，＜0.001），1、2级皆低于3级，高于4级，有统计学意义（1级P值分别为＜0.001，＜0.01;2级P值分别为＜0.01，＜0.01），3级中表达高于4级(P＜0.001)。它在2级HBcAg胞核分布明显高于1、3级（P值分别为＜0.05，＜0.05）。 (10) IL-10在HBcAg胞浆、胞核分布中表达:IL-10在0、1级HBcAg胞浆分布皆高于3、4级，（0级P值＜0.001，＜0.05;1级P值＜0.001，＜0.01）2级低于1级，高于3级（P值分别为＜0.01，＜0.01）。它在0级HBcAg胞核分布低于1、4级(P值分别为＜0.01，＜0.05)。 (11) IFN-γ在HBcAg胞浆、胞核分布中表达:IFN-γ在0级HBcAg胞浆分布明显低于1、2、3、4级，（P值分别为＜0.01，＜0.01，＜0.01，＜0.001）2级低于4级(P＜0.05)。它在HBcAg胞核分布表达无统计学意义(P＞0.05)。 (12) TNF-α在HBcAg胞浆、胞核分布中表达:细胞因子TNF-α在0级HBcAg胞浆分布明显高于1、2、3、4级（P值分别为＜0.05，＜0.001，＜0.01，＜0.001），1级高于2、4级（P值分别为＜0.001，＜0.01），2级低于3级(P＜0.05)。它在0级HBcAg胞浆分布低于2、3级（P值分别为＜0.01，＜0.01），1级也低于2、3级(P＜0.05，＜0.01)。 (13)肝组织病理在HBcAg胞浆、胞核分布中表达:423例患者炎症活动度分级与胞浆HBcAg的分布率呈正相关，G0组患者HBcAg的分布率明显低于G1、G2和G3组(P＜0.01，＜0.001和＜0.01)，G2组明显高于G1、G3组（均P＜0.05），但达到G2后有下降趋势，值得进一步验证。胞核HBcAg的分布率也以G2组明显高于其他各组(均P＜0.05)。肝纤维化分期在HBcAg胞浆、胞核中的表达率均无统计学意义（均P＞0.05）。 2.“补肾法”治疗后HBcAg表达、病理学、病毒学、免疫学指标变化 (1) HBcAg胞浆、胞核阳染率变化:胞核阳染面积百分比均数下降了1.0006，但P=0.539＞0.05，没有统计学意义;而胞浆阳染率百分比均数上升了5.2241，P=0.002＜0.01，治疗组治疗前后，以及与对照组比较，有统计学意义。 (2)肝组织病理学表达:肝组织炎症分级、纤维化分期改善(P＞0.05)，无统计学意义。 (3) HBsAg滴度的变化:80例患者HBsAg阳性滴度下降了21632.51IU/ml，且P＜0.05，有统计学意义;与93例安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后HBsAg阳性滴度下降了20689.3867 IU/ml，且P＜0.05，有统计学意义。 (4) HBeAg滴度的变化:HBeAg阳性表达水平下降了134.3548IU/ml，P＜0.05，有统计学意义;与安慰剂对照组相比，中药治疗组治疗后HBeAg阳性表达水平比对照组低115.0866IU/ml，P＜0.05，有统计学意义。 (5) HBV DNA载量变化:HBV DNA指数下降了0.5638log，P＜0.05，说明DNA有所下降，且具有统计学意义;与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后HBVDNA指数下降了0.483log，且P＜0.05，有统计学意义。 (6) IL-2表达水平的变化:IL-2均数上升了22.5121 pg/ml，P＜0.05，有统计学意义;与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后IL-2上升了21.3036 pg/ml，且P＜0.05，有统计学意义。 (7) IL-4表达水平的变化:IL-4下降了42.5714 pg/ml，P＜0.001，有统计学意义，与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后IL-4下降了42.0477 pg/ml，P＜0.01，有统计学意义。 (8) IL-10表达水平的变化:IL-10下降了1.7844 pg/ml，但没有统计学意义(P＞0.05)，与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后IL-10下降了0.962 pg/ml，无统计学意义。 (9) TNF-α表达水平的变化:TNF-α下降了15.3377pg/ml，P＜0.05，有统计学意义;与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后TNF-α下降了13.3355 pg/ml，P＜0.05，有统计学意义。 (10) IFN-γ表达水平的变化:IFN-γ上升了1.1039 pg/ml，P＞0.05，无统计学意义;与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后IL-2上升了1.6257 pg/ml，P＞0.05，无统计学意义。 结论： 1.建立在肝细胞内HBcAg胞浆、胞核阳染分布数据基础上的量化分层评价，为探讨病毒学、免疫学、病理学指标与

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 肝细胞内HBcAg分布研究在慢性HBV感染自然史中的价值与意义

1．1．1 慢性HBV感染的自然史与肝细胞内HBcAg分布的相关性

1．1．2 文献中较为一致以及冲突的观点

1．2 补肾法治疗慢性HBV携带者的研究及与HBcAg分布的相关性

1．2．1 慢性HBsAg携带者早期干预的必要性

1．2．2 伏邪理论是阐明慢性HBV携带的重要假说

1．2．3 补肾法治疗慢性HBV携带者的理论依据

1．2．4 补肾法治疗慢性HBV携带者的应用研究

第二章 慢性HBV携带者肝细胞内HBcAg分布特点及其临床意义

2．1 资料与方法

2．1．1 资料来源

2．1．2 病例选择

2．1．3 肝组织穿刺

2．1．4 肝脏病理学检查

2．1．5 HBcAg免疫组化染色

2．1．6 肝细胞内HBcAg表达的评价

2．1．7 血清学指标检测

2．1．8 统计学处理

2．2 研究结果

2．2．1 一般情况

2．2．2 肝细胞内HBcAg分布与病毒学、免疫学指标的关系

2．2．3 肝细胞内HBcAg分布与肝组织病理的关系

2．3 讨论

2．3．1 一种新的肝细胞内HBcAg分布分层评价方法

2．3．2 肝细胞内HBcAg分布与病毒学指标的关系

2．3．3 肝细胞内HBcAg分布与免疫学指标的关系

2．3．4 肝细胞内HBcAg分布与病理学分级、分期的关系

第三章 补肾法治疗慢性HBV携带者二次肝穿病例观察及与肝细胞内HBcAg分布的关系

3．1 资料与方法

3．1．1 资料来源

3．1．2 病例入选标准

3．1．3 治疗方法

3．1．4 疗效判定标准

3．1．5 观察指标

3．1．6 质量控制

3．1．7 法规和伦理学

3．1．8 统计学处理

3．2 研究结果

3．2．1 补肾法治疗前后肝细胞HBcAg分布的变化情况

3．2．2 补肾法治疗前后病毒学指标变化情况

3．2．3 补肾法治疗前后免疫学指标变化情况

3．2．4 补肾法治疗前后病理学指标变化情况

3．3 讨论

3．3．1 中医药干预慢性HBV携带者的价值

3．2 补肾法治疗慢性HBV感染的疗效评价

3．3．3 补肾法组方的探讨

3．3．4 课题有关问题和展望

结语

参考文献

附录

附录1：肝细胞内HBcAg分布的检测评价及其临床意义(综述)

附录2：导致慢性HBsAg携带者肝脏病理学改变的相关因素(综述)

附录3：本课题相关数据表格

在读期间发表论文及参与课题情况

致谢