补肾活血方对膝关节假体周围骨吸收及RANKL/RANK/OPG通路的干预研究

摘要

研究目的:
　　近年来，随着我国人口寿命的大幅提高，我国社会亦逐步步入老龄化社会，在此背景下，老年性疾病发病率逐步升高，体现在骨科方面即是退行性疾病及骨质疏松性疾病的发病率逐年升高，而膝OA（骨关节炎）则是目前退行性骨关节炎里面的最常见疾病，而随着我国医疗技术水平的日益提高及社会健康观念的日益提升，老年人追求良好生活质量的愿望较以前更加强烈，因此，愿意接受人工膝关节表面置换术人治疗膝OA的人数大幅增加，因此人工膝关节表面置换术已成为目前临床常见、重要及广泛的治疗手段，尤其是终末期膝OA的常用手段之一，而伴随着此术式的大量应用，膝关节假体的周围骨溶解导致松动的病例数量大幅增加，二次手术不但增加了患者的经济负担及痛苦，同时亦带来了巨大的医疗风险。目前膝关节假体周围骨溶解的可能性较多，存在低毒性感染、应力机制及微粒机制等多种可能，而对应后两种机制，目前西医药防治骨溶解主要以抗骨质疏松治疗，调节骨代谢为主，依据骨质疏松研究中骨代谢机制使用调节骨代谢药物并取得一定的效果，近二十年，中医中药的抗骨质疏松研究无论在基础研究和临床研究上均做了大量工作，并取得了部分成果，但目前在中医药防治人工假体骨溶解方面尚存在大量空白，相关研究较欠缺，把中医中药在抗骨质疏松方面所研究的成果运用在膝关节置换术后的骨量丢失方面目前还是空白，故本人尝试通过研究补肾强筋胶囊干预人工膝关节表面假体周围骨吸收，并通过假体周围骨密度、OPG、RANKL的变化及实验室动物研究等证明其是否具有作用并初步阐明其相关机制。
　　研究方法:
　　临床部分以膝骨关节炎并行膝关节表面置换术患者在研究对象，实验部分采用小鼠通过植入PMMA微粒进行造颅骨板骨吸收模型，通过检测补肾活血方治疗后各组血清OPG、RANKL蛋白浓度及颅骨OPG、RANKLmRNA表达，来揭示不同剂量的补肾活血方与OPG、RANKL变化的关系，并尝试解释补肾活血方与OPG、RANKL的关系，是否具有相关性，具体相关性如何。
　　一、临床观察研究
　　选取我院2013年2月-2014年2月广东省第二中医院骨科病房的膝骨关节炎并行膝关节表面置换术后患者，证型符合者纳入;西医的诊断严格按照标准执行，所有受试对象均需签署知情同意书。试验组27例，对照组25例，采用随机双盲对照研究，两组均行单膝人工关节表面置换术，均采用LINK公司PS型假体行膝关节置换手术治疗，所有假体均用骨水泥固定，所有患者术后均采用相同的康复方法，并于术后分期进行HSS评分。对照组行人工膝关节置换术，术后口服钙尔奇D0.6g/次，2次/日，连续服用26周;试验组除执行手术治疗外，尚口服我院院内制剂补肾强筋胶囊，1粒/次，3次/天，连续服用26周，股骨假体周围分为4个兴趣区，分别为ROI14，胫骨假体周围分为3个兴趣区，分别为RoI1-3，应用双能X线骨密度仪对各个区内的骨密度变化进行观察，两组患者术后1周、3月、6月、12月的HSS评分，应用单因素方差分析进行统计学分析。
　　二、临床试验研究
　　入组患者于清晨空腹抽取静脉血，离心处理后OPG、RANKL的测定均采用ELISA法测定，分别测定术前、术后2周、3月、6月数值并记录分析。膝关节置换手术治疗，采用德国LINK公司PS型假体，所有假体均用骨水泥固定，所有患者术后均采用大致相同的康复方法，并于12个月随访时进行HSS评分。股骨假体周围分为4个兴趣区，分别为ROI1-4，胫骨假体周围分为3个兴趣区，分别为RoI1-3，应用双能X线骨密度仪对各个区内的骨密度变化进行观察，应用单因素方差分析进行统计学分析。
　　三、实验研究
　　选取实验雄性小鼠造模，采用小鼠40只，分为五组，第1组为空白组（假手术组），第2组为造模组模型组，第3组为补肾强筋胶囊低剂量组，第4组为补肾强筋胶囊中剂量组，第5组为补肾强筋胶囊高剂量组，第1组采取假手术处理，2、3、4、5组均自颅项切开后将PMMA颗粒溶液均匀涂抹于颅骨板上，分别予低、中、高剂量灌胃，正常饮食，处死后取颅骨组织，观察并计算颅骨陷窝面积，提取颅骨中央骨组织总DNA采用PCR法行mRNA表达检测分析，并行Western blotting法检测骨组织OPG、RANKL蛋白表达。
　　研究结果:
　　一、临床观察研究
　　（一）HSS评分:
　　结果显示:所有患者经过12个月随访，随访期间患者均无感染、假体松动的情况发生，4例患者有轻微的膝部疼痛，但不影响活动。HSS评分:术后1周试验组平均分48.44分，对照组48.41分，两组无统计学差异(P＞0.05)，术后3月试验组平均得分67.96分，对照组63.72分，两组有显著差异(P＜0.01);术后6月试验组平均得分80.78分，对照组76.08分，两组存在统计学差异(P＜0.05);术后12月试验组平均得分84.00分，对照组82.64分，两组无统计学差异;两组术前与术后1周评分比较，均有显著性差异(P＜0.01);两组术后6月及12月分别前后比较，试验组无统计学差异(P＞0.05)，对照组有显著性差异(P＜0.01)。
　　（二）骨密度观察研究
　　1.ROI1区两组平均骨密度
　　试验组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少20.32％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少11.05％(P＜0.01);与术后3月比较，术后6月平均骨密度下降无统计学意义(P＞0.05);与术后6月比较，术后1年平均骨密度下降无统计学意义(P＞0.05)。
　　对照组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少26.26％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少11.01％(P＜0.05);与术后3月比较，术后6月平均骨密度下降，具有统计学意义(P＜0.05)，较术后1周下降23.73％(P＜0.01);与术后6月比较，术后1年平均骨密度下降无统计学意义(P＞0.05)。
　　两组术后1周平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05);两组术后1年平均骨密度比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.ROI2区两组平均骨密度
　　试验组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少19.30％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少10.31％((P＜0.01));与术后3月比较，术后6月平均骨密度下降无统计学意义(P＞0.05);与术后6月比较，术后1年平均骨密度下降无统计学意义(P＞0.05)。
　　对照组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少25.18％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少9.96％(P＜0.01);与术后3月比较，术后6月平均骨密度下降，具有统计学意义(P＜0.05)，较术后1周下降18.33％(P＜0.01);与术后6月比较，术后1年平均骨密度下降无统计学意义(P＞0.05)。
　　两组术后1周平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05);两组术后1年平均骨密度比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.ROI3区两组平均骨密度
　　试验组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少12.28％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少9.43％(P＜0.01)，术后6月平均骨密度减少11.33％(P＜0.01)。
　　对照组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少12.30％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少9.41％(P＜0.05)，术后6月平均骨密度减少10.33％(P＜0.01)。
　　两组术后1周平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05);两组术后1年平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　4.ROI4区两组平均骨密度
　　试验组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少12.85％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少5.41％(P＜0.05)，术后6月平均骨密度减少9.56％(P＜0.01)。
　　对照组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少14.43％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少5.52％(P＜0.05)，术后6月平均骨密度减少9.46％(P＜0.05)。
　　两组术后1周平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05);两组术后1年平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)
　　5.ROI5区两组平均骨密度
　　试验组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少21.08％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少11.32％(P＜0.05)，术后6月平均骨密度减少17.51％(P＜0.05)。
　　对照组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少23.68％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少10.92％(P＜0.05)，术后6月平均骨密度减少17.69％(P＜0.01)。
　　两组术后1周平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05);两组术后1年平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05).
　　6.ROI6区两组平均骨密度
　　试验组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少14.57％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少8.29％(P＜0.05)，术后6月平均骨密度减少13.53％(P＜0.01)。
　　对照组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少13.17％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少7.92％(P＜0.01)，术后6月平均骨密度减少11.63％(P＜0.01)。
　　两组术后1周平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05);两组术后1年平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05).
　　7.ROI7区两组平均骨密度
　　试验组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少11.25％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少5.90％(P＜0.05)，术后6月平均骨密度减少9.39％(P＜0.01)。
　　对照组:与术后1周比较，术后1年平均骨密度减少11.24％(P＜0.01);与术后1周比较，术后3月平均骨密度减少5.85％(P＜0.01)，术后6月平均骨密度减少9.37％(P＜0.01)。
　　两组术后1周平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05);两组术后1年平均骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　8.术后3月、6月、12月股骨、胫骨密度变化
　　术后3月:试验组股骨远端假体周围骨密度下降率分别为11.05％、10.31％、9.43％、5.41％，平均下降9.05％，对照组股骨远端假体分别为11.01％、9.96％、9.41％、5.52％，平均下降8.98％;试验组胫骨假体周围骨密度下降率分别为11.32％、8.29％、5.90％，平均下降8.50％，对照组胫骨假体周围骨密度下降率分别为10.92％、7.92％、5.85％，平均下降8.23％。
　　术后6月:试验组股骨远端假体周围骨密度下降率分别为18.64％、13.66％、11.33％、9.56％，平均下降12.85％，对照组分别为23.74％、18.33％、10.33％、9.46％，平均下降15.47％;试验组胫骨假体周围骨密度下降率分别为17.51％、13.53％、9.39％，平均下降13.48，对照组为17.69％、11.63％、9.37％，平均下降12.90％。
　　术后12月:试验组股骨远端假体周围骨密度下降率分别为20.32％、19.30％、12.28％、12.85％，平均下降16.19％，对照组股骨远端假体分别为26.26％、25.18％、12.30％、14.43％，平均下降19.54％;试验组胫骨假体周围骨密度下降率分别为21.08％、14.57％、11.25％，平均下降15.63％，对照组胫骨假体周围骨密度下降率分别为23.68％、13.17％、11.24％，平均下降16.03％。
　　二、临床试验研究:
　　（一）OPG结果显示:
　　两组术前及术后3月比较，两组数值相当(P＞0.05)，两组同组间术前及术后3月比较，两组数值均高于术前(P＜0.01);术后6月两组比较，试验组数值高于术前(P＜0.05)，试验组术后6月与术后3月数值比较，低于术后3月(P＜0.05);对照组术后6月与术后3月比较，两组数值相当(P＞0.05)。
　　（二）RANKL结果显示:
　　RANKL两组术前及术后3月比较，两组数值相当(P＞0.05)，两组同组间术前与术后3月数值比较，术后3月均大于术前(P＜0.05);术后3月两组数值相当(P＞0.05);术后6月两组间数值比较，对照组高于试验组(P＜0.05)。
　　（三）OPG/RANKL比值结果显示:
　　两组术前比较，比值相当(P＞0.05);两组术后3月比较，比值相当(P＞0.05);两组术后6月比值比较，试验组高于对照组(P＜0.05)。
　　三、动物实验研究
　　颅骨陷窝观察和面积计算:空白组（假手术组）小鼠卤盖骨骨质结构正常，未见明显骨溶解及骨破坏，模型组与低剂量组、中剂量组面积相当(P＞0.05)，高剂量组面积最小(p＜0.01)。
　　PCR显示:OPG:与空白组比较，各组mRNA的表达水平均不同程度降低(P＜0.05);模型组与低剂量组mRNA的表达水平相当(P＞0.05);高剂量组OPGmRNA的表达水平与中剂量组相当(P＞0.05);高剂量组与低剂量浓度组比较，OPG mRNA的表达水平升高(P＜0.05)。RANKL:与空白组比较，各组mRNA表达水平均不同程度升高(P＜0.05)，模型组mRNA与低剂量组、中剂量组mRNA表达水平相当(P＞0.05);高剂量组mRNA表达水平低于中剂量组(P＜0.05)。
　　Western-blot结果显示:OPG结果显示:与空白组比较，各组蛋白表达水平均不同程度降低(P＜0.05);高浓度组与中浓度组比较，蛋白表达水平相当(P＞0.05);与低剂量组比较，中剂量组表达水平升高(P＜0.05)。RANKL结果显示:与空白组比较，各组蛋白表达水平均不同程度升高(P＜0.05)，模型组与低剂量组、中剂量组蛋白表达水平相当(P＞0.05);高剂量组蛋白表达水平低于中剂量组(P＜0.05)。
　　研究结论:
　　1.补肾活血方在临床疗效研究中可明显改善试验组ROI1区、ROI2区的骨密度下降及骨量丢失，证明补肾活血方虽然不能阻止膝关节置换术后周围骨量的丢失，但能够一定程度上减少骨丢失量，有利于改善膝关节术后假体周围骨吸收程度。
　　2.补肾活血方可以改善人工膝关节置换术后功能及症状;
　　3.补肾活血方可有效改善肝肾不足，筋脉瘀滞症候;
　　4.补肾活血方可以提高血清OPG浓度及升高OPG/RANKL值;
　　5.高剂量的补肾活血方可显著提高骨溶解模型小鼠的颅骨OPG蛋白表达及mRNA表达水平，抑制RANKL蛋白表达及mRNA表达水平，提高OPG/RANKL比值，抑制骨溶解。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

一、膝关节置换术后假体松动机制机制及骨溶解相关机制

(一)机械因素

(二)生物因素

(三)个体差异

二、骨溶解与细胞因子

三、RANK／RANKL／OPG系统的作用及相关机制

四、人工膝关节置换术后假体周围骨密度下降的内在机制及其测量

(一)膝关节置换术后假体周围骨密度下降的原因

(二)假体周围骨密度变化的规律

(三)测量假体周围骨密度的方法的选择及影响

(四)应力遮挡与骨溶解及假体松动的关系

五、中医药目前相关研究

(一)中药方剂研究

(二)单味中药研究

六、总结

第二章 临床研究

一、研究资料

(一)一般资料

(二)诊断标准

(三)纳入标准

(四)排除标准

(五)脱落与剔除标准

(六)终止试验标准

(七)病情程度分级标准

二、研究方法与材料

(一)病例分组

(二)治疗方案

(三)观测指标及方法

(四)数据资料的质量控制

(五)依从性解决方案

(六)统计学处理

三、结果

(一)一般资料

(二)治疗后平均骨密度变化情况

(三)临床疗效变化

(四)外周血OPG、RANKL、OPG／RANKL

(五)中医证型变化

(六)安全性观测结果

第三章 动物实验研究

第一节 小鼠颅骨骨溶解造模及观察

一、实验材料

二、实验方法

三、标本的采集及检测

四 结果

第二节 小鼠颅骨OPG、RANKLmRNA表达水平的研究

一、材料

二、RNA提取方法

三、引物设计与合成

四、Real-time PCR反应

第三节 小鼠颅骨OPG、RANKL蛋白表达的研究

一、实验设备及试剂

二、实验步骤

三、Western blot显影结果

四、灰度值统计结果

第四章 讨论

一、人工膝关节假体周围骨吸收与骨质疏松的关系

二、假体周围骨吸收与骨溶解的关系探讨

三、假体周围骨吸收与目前无菌性松动的防治的研究探讨

四、假体周围骨密度变化的规律及补肾活血方干预骨吸收疗效探讨

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢