鼠RANK/RANKL胞外复合体的晶体,制备其的方法及其应用

摘要

本发明提供了纯化和表达RANK胞外区域蛋白的方法，还提供了制备RANK/RANKL复合体晶体的方法以及该RANK/RANKL复合体的三维晶体结构，以及该晶体在医药领域中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及纯化和表达RANK胞外蛋白的方法，还提供了一种RANK/RANKL复合体的晶体，尤其提供了一种鼠RANK/RANKL胞外蛋白形成的晶体。本发明提供了一种制备鼠RANK/RANKL胞外复合体晶体的方法，以及该复合体结构在医药领域中的应用。

背景技术

肿瘤坏死因子(TNF)家族中的细胞因子在诸如炎症反应、器官发生、宿主防御、自身免疫和细胞凋亡等多种生物功能中扮演着重要的角色。这些生物调节因子是通过受体-配体相互作用，从而引发细胞内的信号传递以及细胞表型的改变而发挥相应的生理作用的。作为TNF家族成员的RANKL以及其受体RANK在生物体内的多种活动中扮演着重要的角色，其对于骨的重塑过程起到了重要的调节作用，并且RANK以及RANKL分子之间的相互作用还可调节T细胞/树突状细胞的信号传导、树突状细胞的存活以及淋巴组织的发育，近年来受到了广泛的关注。

在人体骨的重塑过程中，破骨细胞是骨重塑的“启动子”，成骨细胞是骨重塑的“调节者”，骨吸收类疾病共同的病理特征为破骨细胞调节异常导致骨形成和骨吸收之间丧失平衡，因此深入了解破骨细胞的激活机制将对于成功防治骨吸收类疾病的发生有着至关重要的意义。1997年，几个不同的研究小组发现了肿瘤坏死因子受体-配体超家族新成员：骨保护蛋白(osteoprotegerin，OPG)、RANKL以及RANK；随后，多项研究相继显示：RANKL、OPG具有调节破骨细胞分化、发育、影响其功能的作用，RANK是RANKL、OPG发挥作用的关键，它们形成一个骨调节轴，来调节骨的重塑过程。

RANKL为一种II型跨膜蛋白，其多为三个单体聚合成的复合体，主要分布在活化T细胞、骨髓基质细胞及成骨细胞等细胞中，目前认为哺乳动物中存在三种RANKL蛋白：RANKL1、RANKL2、RANKL3，其中前两种为膜结合蛋白，后一种为被分泌到胞外的可溶性蛋白。人和大鼠的RANKL分子分别包含317、316个氨基酸残基，具有87％的同源性；人类RANKL基因位于13q14，其启动子区包含成骨细胞分化的关键转录因子cbaf-1的活性。RANKLmRNA可在多种组织表达，以骨骼和淋巴组织中最高，在骨骼中，RANKL主要表达于骨小梁和骨髓；在骨髓基质细胞和成骨细胞均可检测到RANKL mRNA。2004年Ito S等人以及国际专利申请NO.WO 03/014077都披露了RANKL的三维结构，其全部内容结合于此作为参考。各项研究表明：每一个RANKL单体包括一个夹层结构，其由两个平面反平行β-折叠片层构成。第一个片层由β-链A”、A、H、C及F组成，第二个片层由B’、B、G、D及E组成，其中第一片层为内层β-片层，该片层富含疏水性氨基酸，并通过疏水作用与另外两个RANKL相互结合，而B’、B、G、D及E链形成外层β-片层，该片层多为带电及极性氨基酸，负责与受体RANK结合；每一个RANKL单体中的β-夹层结构的一个边缘、链E及F包裹相邻单体的AHCFβ-片层的内部疏水层从而形成RANKL三聚体结构。RANKL三聚体的晶体结构特征是：具有P2₁2₁2₁的空间群，晶胞参数为以及空间群R3，胞晶为其形状就像被截平了的锥形，靠近膜的一端宽于远端的顶点处。RANKL三聚体高底部直径约为顶点处的直径约为

RANK是RANKL的受体，属于TNF受体家族，是一种I型跨膜蛋白，人RANK分子在破骨细胞前体细胞和成熟破骨细胞内表达量较高。RANK基因定位于18q22.1，其编码的蛋白质在体内以跨膜蛋白型存在，其表达于单核-巨噬细胞系、破骨细胞前体细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等，表达于破骨细胞前体细胞膜表面的RANK介导RANKL的信号，发挥调节破骨细胞分化的功能。

当配体RANKL与受体RANK的胞外区域结合后，导致了RANK的激活，活化后的RANK通过其胞内区域的TRAF结合域与TRAF 1、2、3、5、6等蛋白结合，并且通过这些TRAF蛋白激活细胞内的两条重要的信号通路：JNK/SAPK通路和NFκB信号通路。这两条信号通路的激活诱导了与破骨细胞分化相关的基因的表达，最终促进了破骨细胞的分化与成熟。而且，各种骨代谢调节因子、激素参与RANKL-RANK-OPG轴信号的调节。与其它信号途径一样，RANKL-RANK-OPG轴信号也存在正反馈和负反馈调节。1α，25-(OH)₂D₃、甲状旁腺素、前列腺素E2、白介素1、IL-6等骨吸收因子分别通过维生素D受体介导通路、蛋白激酶A介导通路、gp130/STAT介导通路上调成骨细胞/骨髓基质细胞RANKL mRNA表达；IL-1、TNF-α分别通过激活破骨细胞表面的IL-1R和TNFR1加强RANKL信号；TGF-β则可增加破骨细胞表面的RANK上调RANKL信号。

作为RANKL-RANK-OPG信号系统调控破骨细胞分化的中心环节，RANKL与RANK之间的相互作用及其促使RANK活化的微观机制一直以来是骨吸收类疾病研究领域的热点问题。其焦点问题之一是RANKL、RANK蛋白以及RANKL-RANK复合体的晶体结构。虽然目前已经获得了RANKL蛋白的晶体结构，但是仍然没有获得RANK蛋白以及RANK/RANKL复合体的晶体结构，正是由于对该结构的认识不足，所以学者们对于RANKL-RANK-OPG信号体系如何被调控，以及受调控后RANKL-RANK-OPG执行信号传递的微观机制尚无明确的认识。这严重影响了有关骨吸收类疾病致病机制的探索以及抗骨吸收药物的研究。

分析目前还未获得RANK蛋白以及RANKL-RANK复合体的晶体结构的原因主要有以下两点：1.RANK蛋白较难于制备和纯化。在RANK被发现至今的时间里，一直无RANK蛋白E.coli表达以及纯化的相关报道。2.相对于包含RANKL在内的TNF蛋白家族成员所具有的较刚性的结构，包括RANK在内的TNFR蛋白家族成员其结构具有较大的可变性，因而更难于获得结晶。

发明内容

本发明提供了一种蛋白复合体晶体，其中所述复合体包括鼠RANK/RANKL胞外区域蛋白的氨基酸序列。所述鼠RANKL的胞外区域是指所述RANKL单体C-末端从161位氨基酸至316位氨基酸，所述RANK的胞外区域是指所述RANK单体N-末端从26位氨基酸至210位氨基酸。

根据本发明提供的鼠RANK/RANKL复合体晶体中，所述晶体属于P6₃六边形空间群组，晶胞尺寸是和

在本发明提供的晶体中，该复合体包括由三个RANKL单体链形成的三聚体内核，以及另三个RANK单体链。RANK单体链分别结合在RANKL三聚体内核上，从而形成六聚体。每个RANK受体结合到由相邻两个RANKL配体亚单位形成的裂缝中；该六聚体复合体具有的溶剂可及表面积，由RANK贡献RANKL贡献

在本发明提供的晶体中，RANK单体链的环120S(即残基122-127)完全与配体RANKL结合，在RANK单体链的两个区域，即残基182-185，以及残基194-196形成2个短的β-片层构象，从而进一步形成较为有序的结构域。

在本发明提供的晶体中，在所述复合体中，RANK邻近跨膜区域的胞外区域，即残基154-199是非常有序的，该残基154-199区域包括CRD4结构域。

在本发明提供的晶体中，每一个RANK单体链都存在一个钠离子，该钠离子可与RANK/RANKL中的Cys-134，Ala-135，Phe-138、Val-163以及骨架上的Ser-161侧链的羰基基团螯合。

在本发明提供的晶体中，每一个RANK单体的Asp-85与RANKL中的Lys-281和Arg-283形成极性相互作用，RANK中的Glu-76与RANKL中的Gly-191的骨架形成氢键，RANK中的Asp-124和Glu-126与RANKL中的His-179以及Lys-180形成极性相互作用，RANK中的Arg-129和Arg-130分别与RANKL中的Glu-225、Asn-266和Asp-268相互作用，RANK环100S(残基102-112)上的Ser-123骨架(主干，backbone)羰基基团与RANKL的Lys-180相互作用形成氢键；RANK的环90S残基Asp-94和Lys-97与RANKL中的Arg-222、Asp-299和Asp-301形成极性相互作用。

本发明提供了一种表达和纯化RANK胞外蛋白的方法，包括：(1)构建具有编码RANK胞外区域的cDNA的载体，将该载体转化到原核细胞中，从而得到以包涵体形式表达的重组RANK；(2)对该包涵体进行超声处理，然后重新溶解在6M的盐酸胍中，得到解离状态的重组RANK；(3)重新折叠所述重组RANK；(4)利用琼脂糖75色谱柱分离出重组RANK；(5)通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)收集并分析正确折叠的RANK。本发明提供的方法尤其适用于鼠RANK胞外区域蛋白的表达与纯化。

在本发明提供的表达和纯化方法中，编码RANK蛋白的cDNA为鼠RAW264.7细胞的mRNA经逆转录PCR技术所获得的产物。

在本发明提供的表达和纯化方法中，采用的原核细胞为E.coli菌株BL21-Gold。

本发明还提供了一种制备RANK/RANKL胞外区域复合体晶体的方法，包括：(1)RANKL胞外区域的表达与纯化：利用谷胱苷肽巯基转移酶融合蛋白方式表达可溶性RANKL，并且利用谷胱苷肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione-Sepharose fast flow 4B beads)通过亲和纯化法纯化该融合单体，用PreScission蛋白酶进行切割。被切下的RANKL用琼脂糖75色谱柱纯化，从而得到纯化后的RANKL的胞外区域单体。(2)将根据上述表达和纯化RANK的方法而得到的RANK单体与该RANKL，在pH 7.00的1M TRIS缓冲溶液中浓缩成10mg/mL，并以1∶1比例混合；(3)在温度为294K的条件下，利用高通量纳升坐滴蒸汽扩散方法形成RANK-RANKL胞外区域的晶体；(4)所述晶体在0.1M磷酸二氢钠，2M氯化钠，0.1M二氢磷酸钾和0.1M MES(pH 6.5)的条件下生长。该方法尤其适用于鼠RANK/RANKL胞外区域复合体晶体的制备。

在本发明提供的形成RANK/RANKL复合体结晶的方法中，得到的晶体还可以在20％的PEG 3350以及0.2M的甲酸铵中生长。该生长条件尤其适用于鼠RANK/RANKL胞外复合体晶体的生长。

根据本发明提供的RANK/RANKL复合体晶体在筛选治疗骨吸收类疾病或抗骨吸收药物中的应用，包括：根据复合体的晶体结构，通过计算机模拟来设计能阻断复合体形成的任一多肽、蛋白质、抗体、免疫结合物、无机物或有机物，其中所述多肽、蛋白质、抗体、免疫结合物、无机物或有机物可以作用的位点选自以下作用位点组成的组中的一个或多个：RANK的Asp-85与RANKL中的Lys-281和Arg-283形成的作用位点、RANK中的Glu-76与RANKL中的Gly-191的骨架形成的作用位点、RANK中的Asp-124和Glu-126与RANKL中的His-179以及Lys-180形成的作用位点、RANK中的Arg-129和Arg-130分别与RANKL中的Glu-225、Asn-266和Asp-268形成的作用位点、RANK环100S上的Ser-123的骨架羰基基团与RANKL中的Lys-180形成的作用位点、RANK的环90S残基Asp-94和Lys-97与RANKL中的Arg-222、Asp-299和Asp-301形成的作用位点，以及所述RANK单体链的环120S的残基，即残基122-127；其中，使得RANK与RANKL的结合力下降30％的多肽、蛋白质、抗体、免疫结合物、无机物或有机物为候选化合物；通过生物学实验确定所述候选化合物在治疗骨吸收类疾病或抗骨吸收药物中的应用。

附图说明

图1示出了RANK/RANKL复合体的三维结构；

图2A示出了复合体中三个RANK单体重叠的结果；

图2B示出了RANK单体与TNFR1重叠、RANK与DR5重叠所得到的结果；

图3示出了RANKL的构型以及结合状态与未结合状态的RANKL的重叠得到的结果；

图4示出了受体与配体相互作用中的上接触区域以及下接触区域；

图5示出了TNFβ-TNFR1，Trail-DR5，和RANKL-RANK三种复合物的上接触层中的疏水键；

图6A示出了在RANK/RANKL相互作用中的重要残基；

图6B是在图6A的基础上加有深色背景，以更清楚的识别RANK/RANKL相互作用中的重要残基；

图7示出了mRANK与DR5以及TNFR1之间的等效氨基酸对。

具体实施方式

一、表达及纯化

1.鼠RANK胞外区域蛋白的表达及纯化

鼠RANK的氨基酸序列如下：

MAPRARRRRQLPAPLLALCVLLVPLQVTLQVTPPCTQERHYEHLGRCCSRCEPGKYLSSKCTPTSDSVCLPCGPDEYLDTWNEEDKCLLHKVCDAGKALVAVDPGNHTAPRRCACTAGYHWNSDCECCRRNTECAPGFGAQHPLQLNKDTVCTPCLLGFFSDVFSSTDKCKPWTNCTLLGKLEAHQGTTESDVVCSSSMTLRRPPKEAQAYLPSLIVLLLFISVVVVAAIIFGVYYRKGGKALTANLWNWVNDACSSLSGNKESSGDRCAGSHSATSSQQEVCEGILLMTREEKMVPEDGAGVCGPVCAAGGPWAEVRDSRTFTLVSEVETQGDLSRKIPTEDEYTDRPSQPSTGSLLLIQQGSKSIPPFQEPLEVGENDSLSQCFTGTESTVDSEGCDFTEPPSRTDSMPVSPEKHLTKEIEGDSCLPWVVSSNSTDGYTGSGNTPGEDHEPFPGSLKCGPLPQCAYSMGFPSEAAASMAEAGVRPQDRADERGASGSGSSPSDQPPASGNVTGNSNSTFISSGQVMNFKGDIIVVYVSQTSQEGPGSAEPESEPVGRPVQEETLAHRDSFAGTAPRFPDVCATGAGLQEQGAPRQKDGTSRPVQEQGGAQTSLHTQGSGQCAE

划线部分为鼠RANK胞外区域的氨基酸序列

材料

寡聚核苷酸由Sangon Biotech(China)制备而成；从Fermentas购得限制性内切酶、T4 DNA连接酶以及第一链cDNA合成试剂盒；从Tiangen Biotech(China)购得pfu DNA聚合酶；从Sigma购得谷胱苷肽(还原型和氧化型)；谷胱苷肽琼脂糖凝胶4B获自通用电气医疗集团(GE Healthcare)；TRIZOL试剂购自Invitrogen.Inc.；所有其它得化学物质均为分析纯。

质粒及菌株

编码成熟鼠RANK胞外区域(残基26-210)的cDNA为鼠RAW264.7细胞的mRNA经逆转录PCR技术所获得，并且克隆到pET28载体(Novagen)中。用于GST-RANKL表达的质粒(残基159-361)获赠于Daved H.Fremont教授(Department of Pathology andImmunology，Washington University School of Medicine，USA.)，用E.coli菌株BL21-Gold(购买于Stratagene公司)表达重组蛋白。

表达及纯化

在E.coli菌株BL21-Gold(DE3)中，重组RANK主要以包涵体形式表达。该包涵体通过超声处理而被纯化并且重新溶解在6M的盐酸胍中。重组RANK的重新折叠通过如下步骤而实现的：该包涵体稀释在包含20mM的Na₂HPO₄(pH 7.3)、1M L-精氨酸、20％甘油、10mM还原型谷胱苷肽以及1mM氧化型谷胱苷肽的复性(IB)溶液中，然后在含有20mM的Na₂HPO₄(pH 7.3)、0.5M L-精氨酸、10％甘油的重新折叠缓冲液1中4℃下透析12小时，然后在含有20mM的Na₂HPO₄(pH 7.3)、0.2M L-精氨酸、5％甘油的重新折叠缓冲液2中4℃下透析12小时，最后在20mM的Na₂HPO₄(pH 7.3)、0.2M L-精氨酸中4℃下透析12小时，在20000g离心10分钟后，将上清液用75(Superdex75)色谱柱(购自Amersham pharmacia公司)进行纯化，并且收集正确折叠的鼠RANK，并用SDS-PAGE分析。

2.RANKL的表达和纯化

鼠RANKL的氨基酸序列如下：

MRRASRDYGKYLRSSEEMGSGPGVPHEGPLHPAPSAPAPAPPPAASRSMFLALLGLGLGQVVCSIALFLYFRAQMDPNRISEDSTHCFYRILRLHENADLQDSTLESEDTLPDSCRRMKQAFQGAVQKELQHIVGPQRFSGAPAMMEGSWLDVAQRGKPEAQPFAHLTINAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKISNMTLSNGKLRVNQDGFYYLYANICFRHHETSGSVPTDYLQLMVYVVKTSIKIPSSHNLMKGGSTKNWSGNSEFHFYSINVGGFFKLRAGEEISIQVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVQDID

划线部分为鼠RANKL胞外区域的氨基酸序列

鼠RANKL的可溶性胞外区域是以谷胱苷肽巯基转移酶融合蛋白形式表达的；融合蛋白利用谷胱苷肽琼脂糖凝胶4B(购自Amersham pharmacia公司)进行亲和纯化，用PreScission蛋白酶进行切割；酶切所得的RANKL用琼脂糖75(Superdex 75)色谱柱(购自Amersham pharmacia公司)纯化。

二、RANK/RANKL复合体的结晶化

以1∶1的比例混合两种纯化得到的RANK单体蛋白以及RANKL单体蛋白而制得RANK/RANKL复合体蛋白溶液。在温度为294K的条件下，利用高通量纳升坐滴蒸汽扩散方法(sitting dropvapour diffusion method)形成RANK/RANKL胞外区域的晶体网格(crystallization screen)，并且利用牛津蛋白产物工具中的自动结晶图像系统进行监控(Mayo等2005，Walter等2005)。向初始的晶体网格给予9次冲击(hit)，这9次冲击中采用的条件：PEG3350和低浓度的无机盐(包括醋酸铵、甲酸铵或硝酸铵)，每次都会有一个发生变化。在以下两个优选条件下得到了生长情况最好的晶体：1)0.1M磷酸二氢钠，2M氯化钠，0.1M二氢磷酸钾和0.1M MES(pH 6.5)；2)20％的PEG 3350以及0.2M的甲酸铵，结晶液滴中含有100nL蛋白溶液以及100nL池液。在这两个条件下生长的晶体具有相同的形态学，通常为具有六角形横截面的长棒状。这些晶体通常在一周之内出现，并且可以在两个月内继续生长直至最大尺寸。

三、鼠RANK/RANKL胞外区域复合体晶体的测定

在条件1下得到RANK/RANKL复合体晶体的X-射线数据是在ESRF，利用光束线ID23-EH2得到的。在下，从单晶的2个位置收集到衍射震荡为1.0°的180个图像。

在波长下，利用钻石的光束线103得到了条件2下生长的复合体晶体的X-射线数据。25％甘油作为冷冻保护剂加入到结晶液滴中，晶体被冷冻起来并且在整个数据采集阶段，采用氮气的冷冻流来保持晶体处于100K。利用HKL2000(Ref.)对数据图像进行索引，积分和合并。表1中给出了对X-ray数据的统计数据。

四、结果解析：

1.晶体测试结果

表1x-射线衍射结果

括号中的数据是高分辨率的结果。R_work和R_free定义为R＝∑_hkl||F_obs|-|F_calc||/∑_hkl|F_obs|，其中h，k，l是指反射指数(用于R_work精细化；5％，不用于R_free的精细)，F_obs和F_calc是结构因子，从测量的强度中推论出来并通过模型计算出来。

平均B因子用于蛋白，水和其他原子

RANK/RANKL复合体晶体属于P6₃六边形空间群组，晶胞尺寸是和

2.RANK/RANKL复合体的结构解析

2.1结合状态的RANK结构

在RANK/RANKL复合体晶体中，RANK单体之间在胞外区域并不相互接触。它们分别结合到RANKL同源三聚体的三个大沟(groove)并且展现出一个三重对称性。复合体中RANK的三个单体在构型中具有非常高的相似性，并且以有序的方式排列(图1以及图2A)，具有的均方根差(RMSD)。但是在整体结构上，复合体中的RANK采取与未结合配体RANK相似的构型，利用VegaZZ 2.1软件分析可知，基于Cα原子相对应的CRD的成对重叠，呈现出RMSD的范围为从CRD3中的到CRD2中的整个分子作为一个紧密单元的重叠得到的RMSD是

复合体中的RANK的有序部分包括四个CRD，这一点与其它的已经解析了的TNF受体家族成员，包括TNFR1和DR5存在显著差异，已经解析的TNF受体家族成员的CRD4是无序的或完全缺失的。RANK和与TNFβ结合的TNFR1的重叠(superposition)以及RANK和与TRAIL结合的DR5的重叠同样显示出，在所有CRD中，CRD2结构域的结构相似性最大(见图2B)，RANK与TNFR1相比，基于Cα原子的CRD2的RMSD为RANK与DR5相比，RMSD为而RANK的CRD1结构域与TNFR1也具有高度的结构相似性，RANK与TNFR1相比，RMSD为但RANK与DR5的CRD1具有较差的结构相似性，因为DR5的前20个残基非常无序。两个重叠都示出，在CRD3的N末端包括DE环(DE loop)的CRD3具有较低的结构相似性(见图2B)，而CRD3被认为是受体配体相互作用(TNF家族复合体成员与它们的受体之间)的重要结构基础之一。与TNFR1和TNFβ的结合相比，RANK与RANKL的结合使得RANK的CRD2与CRD3之间的连接处(Ala-114)，的扭转角度发生大约30度的改变，与DR5与TRAIL的结合相比，RANK的CRD3的N末端扭转角度发生约25度的改变，这样，由于CRD3之间的差异以及结合过程中扭转角度的改变的差异，可以在不同TNF超家族成员的受体结合表面实现不同的几何构型的差异。

据报道在TNFβ-TNFR1复合体中，受体胞外区域的C末端亚区域(CRD4)(其邻近于受体的跨膜区域)是无序的。在TRAIL-DR5中，有人报道DR5的CRD3的C末端部分(残基104-130)仅在假定的跨膜螺旋之前，表现出在一个方向上的刚体转动；另一个报道中示出在六个DR5受体分子中，有四个DR5分子的该区域都是高度无序的。然而，在RANK/RANKL复合体中，RANK邻近跨膜区域的胞外区域(残基154-199，包括CRD4区域)是非常有序的并且表现出一个刚性的构象。

有趣的是，在未结合和结合状态，每一个RANK单体在CRD3亚区域以及CRD4亚区域之间的螺旋区域中观察到一个与之结合的金属离子。根据结合位点的平均键长，计算得到的该金属离子的平均钙键-化合价总和(CBVS，calcium bond-valence sum)为1.2，对于钠离子，CBVS的预期值为1.6，钾离子为0.6，钙离子为2.0，锰离子为3.2，镁离子为4.2(Mulle等，2003)，所以推断该金属离子为钠离子；通过在波长下收集到的数据计算出的异常绕射差异图(anomalous difference map)，该推断被进一步证实，目前为止在其它TNF受体家族成员中尚未有相似报道。这个金属离子可与复合体中的Cys-134、Ala-135、Phe-138和Val-163以及骨架(主干，backbone)Ser-161的侧链的羰基基团螯合。

2.2复合体中的RANKL结构

在RANK/RANKL复合体中的RANKL整体结构与未结合的RANKL的结构非常相似。与其它TNF超家族成员相同，RANKL单体包括两个平的β-片层：β-链A”，A，H，C以及F，其形成内β-片层并加入到内部亚单位之间的相互作用中；β-链B’，B，G，D以及E，其形成外β-片层(见图3)。相比复合体中的RANKL以及自由状态的RANKL，通过与受体结合，RANKL表面的环(loop)发生了一些构型上的改变。重叠结合状态以及自由状态的RANKL分子，基于残基161-316，得到的RMSD为0.57。在未结合状态下的高度弯曲的AA”环、CD环、DE环、和EF环都是非常有序的，在这些环之中，DE环被认为是介导受体-配体相互作用的重要的区域(见图3)。

2.3.复合体中RANK与RANKL的相互作用

RANK/RANKL六聚体中的受体-配体相互作用反映出TNF超家族复合体中常见的特性，即一个受体结合到由相邻两个配体亚单位形成的缝隙中，RANK/RANKL的六聚体复合体具有的溶剂可及表面积，受体贡献配体贡献RANKL以及RANK之间的相互作用可便利的分成两个区域，这与TNFR1-TNFβ复合体以及DR5-TRAIL复合体中的相似：上接触区域以及下接触区域(图4)。这种区分主要是基于受体的两个环的位置：环70S(残基73-86)和环110S(残基114-132)，它们介导了主要相互作用。

在TNFR1-TNFβ复合体以及DR5-TRAIL复合体的上接触区域中，疏水作用是主要的相互作用力，在TNFβ中的Tyr-108以及TRAIL中的酪氨酸-216被认为是这种相互作用中的关键性氨基酸。在这个区域周围的残基以及一些疏水残基，包括在TNFβ中的Val-112以及TRAIL中的Ile-220形成疏水束与外包(outpocketing)疏水残基，包括TNFR1的Leu-67、Leu-71以及DR5中的Leu-57、Leu-61分别在CRD2的第一半区域相互作用(图5)。与之相反地，RANK/RANKL复合体中的这个接触区域，尽管存在疏水残基，但RANKL中的Ile-248(等价于TNFβ中的Tyr-108，TRAIL中的酪氨酸-216)、在疏水相互作用中的两个其它的重要疏水残基，即在TNFβ以及TNFR1中分别是Val-112和Leu-67(在TRAIL以及DR5中分别是Ile-220、Leu-57)已经被两个带电的残基取代，在RANKL中为His-252和RANK中的Glu-84(图中未示出)。同时，从晶体结构图上分析，RANK/RANKL复合体的上接触区域中的剩余的两个疏水残基也彼此相离很远。因此，RANK/RANKL相互作用处的疏水性相互作用与其它两个复合体相比，似乎并不起决定性作用。除了疏水性相互作用之外，RANKL-RANK复合体的上接触区域中的相互作用处是由若干极性或电荷相互作用而构成的。例如，在RANK的Asp-85与RANKL中的Lys-281和Arg-283形成极性相互作用，RANK中的Glu-76与RANKL中的Gly-191的骨架形成氢键(图6A，图6B及表2)。

表2RANK参与到RANK/RANL相互作用的残基

  位点  氨基酸  相应于RANKL中的残基  化学键  76  Glu  Gly-191  氢键  85  Asp  Arg-283；Lys-281  盐键和氢键  94  Asp  Arg-222  盐键  97  Lys  Asp-299；Asp-301  盐键和氢键  124  Asp  His-179；Lys-180  盐键和氢键  126  Glu  Lys-180  盐键  129  Arg  Glu-268  盐键  130  Arg  Glu-225；Asn-266  盐键和氢键

RANK/RANKL复合体中的下接触区域远大于上接触区域，具有的溶剂可及表面积，约为总所占面积的64％。RANK的环110S占有所形成面积的大部分(65％)，在这个环上的四个残基，Asp-124，Glu-126，Arg-129以及Arg-130对于接触起到决定性作用。如6所示，RANK中的Asp-124和Glu-126与RANKL中的His-179以及Lys-180形成极性相互作用，RANK中的Arg-129和Arg-130分别与RANKL中的Glu-225、Asn-266和Asp-268相互作用。除此之外，在环100S上的Ser-123的骨架(主干，backbone)羰基基团与RANKL的Lys-180相互作用形成氢键。RANK的环90S(残基93-101)也参与到下接触区域的相互作用中(大约28％)。在这个环中，RANK中的Asp-94和Lys-97与RANKL中的Arg-222、Asp-299和Asp-301形成极性相互作用。

将参加到RANK/RANKL相互作用的残基与参加到其它TNF超家族成员与其受体的相互作用中的残基相比，仅可以在TRAIL-DR5复合体中找到一个等价的结合对，即Asp-67至Arg-191(见图7)。在其它复合体中的一些残基，诸如TNFR1中的Arg-77和在DR5中的Glu-98，Arg-101，Lys-102，其分别等效与RANK中的位置Asp-94，Glu-126，Arg-129，Arg-130，也参与到受体和配体的相互作用中，根据结构分析，它们结合的残基并不等价于在RANK/RANKL复合体中的那些残基。从配体-受体相互作用处的低保守性残基，以及缺少疏水性相互作用中，我们可以得出RANK/RANKL相互作用的特殊结构特征。

3.进一步利用biacore仪器分析验证RANKL蛋白上与RANK/RANKL相互作用相关的几个关键位点：

表3RANKL突变体与RANK的结合常数

  野生RANKL及其突变体  结合常数(KD)  野生RANKL  4.48×10^-11

  野生RANKL及其突变体  结合常数(KD)  180  3.37×10^-10  222  6.90×10^-9  225  1.50×10^-9  266  8.84×10^-11  268  5.23×10^-10  281  9.23×10^-11  283  1.43×10^-10  299  1.05×10^-9  301  7.22×10^-10

结果显示，这些关键位点的氨基酸突变成丙氨酸或甘氨酸后，其结合常数值都大幅度增加，表明RANKL突变体与RANK的结合能力大幅下降，充分证明这些位点在RANK/RANKL相互结合中的重要作用，也充分证明了计算机模拟结果的准确性。

结合以上说明，本发明揭示出了RANK/RANKL复合体的晶体结构，从上述晶体结构中，不难找到这些复合体相互作用中的重要残基。根据NCBI网站www.ncbi.nlm.nih.gov上Blast的分析结果，鼠与人的RANK胞外区域同源性为83％，鼠与人的RANKL胞外区域同源性为90％，因此，利用这些信息，我们可以继续探寻RANK/RANKL所引起的生物活性的激活途径，设计出能够调节相关生物激活途径的药物，从而进一步达到所需生理活性的作用。根据所述复合体的晶体结构，通过计算机模拟可以设计出能阻断所述复合体形成的任一多肽、蛋白质、抗体、免疫结合物、无机物或有机物，其中所述多肽、蛋白质、抗体、免疫结合物、无机物或有机物可以作用的位点选自以下作用位点组成的组中的一个或多个：RANK的Asp-85与RANKL中的Lys-281和Arg-283形成的作用位点、RANK中的Glu-76与RANKL中的Gly-191的骨架形成的作用位点、RANK中的Asp-124和Glu-126与RANKL中的His-179以及Lys-180形成的作用位点、RANK中的Arg-129和Arg-130分别与RANKL中的Arg-225、Asn-266和Asp-268形成的作用位点、RANK环100S上的Ser-123的骨架羰基基团与所述RANKL中的Lys-180形成的作用位点、RANK的环90S残基Asp-94和Lys-97与RANKL中的Arg-222、Asp-299和Asp-301，以及所述RANK单体链上的环120S的残基形成的作用位点，其中，使得RANK与RANKL的结合力下降30％的多肽、蛋白质、抗体、免疫结合物、无机物或有机物为候选化合物；通过生物学实验确定所述候选化合物在治疗骨吸收类疾病或抗骨吸收药物中的应用。

上文中，基于特定优选的实施方式描述了本发明，然而在不违背所附权利要求中所限定的本发明的精神和范围的情况下，可增加多种变化和修改，这对于本领域中的普通技术人员应当是显而易见的。

序列表

<110>中国人民解放军总医院

     北京表源生物技术有限公司

<120>鼠RANK/RANKL胞外复合体的晶体，制备其的方法及其应用

<130>P21357BYSW

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>625

<212>PRT

<213>鼠RANK蛋白

<400>1

Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Gln Leu Pro Ala Pro Leu Leu

1                5                   10                 15

Ala Leu Cys Val Leu Leu Val Pro Leu Gln Val Thr Leu Gln Val Thr

            20                  25                 30

Pro Pro Cys Thr Gln Glu Arg His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys

        35                  40                  45

Ser Arg Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Leu Ser Ser Lys Cys Thr Pro Thr

    50                  55                  60

Ser Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Thr

65                  70                  75                  80

Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Val Cys Asp Ala Gly

                85                  90                  95

Lys Ala Leu Val Ala Val Asp Pro Gly Asn His Thr Ala Pro Arg Arg

            100                 105                 110

Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys

        115                 120                 125

Arg Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Phe Gly Ala Gln His Pro Leu

    130                 135                 140

Gln Leu Asn Lys Asp Thr Val Cys Thr Pro Cys Leu Leu Gly Phe Phe

145                 150                 155                 160

Ser Asp Val Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys

                165                 170                 175

Thr Leu Leu Gly Lys Leu Glu Ala His Gln Gly Thr Thr Glu Ser Asp

            180                 185                 190

Val Val Cys Ser Ser Ser Met Thr Leu Arg Arg Pro Pro Lys Glu Ala

        195                 200                 205

Gln Ala Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Val Leu Leu Leu Phe Ile Ser Val

    210                 215                 220

Val Val Val Ala Ala Ile Ile Phe Gly Val Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly

225                 230                 235                 240

Lys Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp Asn Trp Val Asn Asp Ala Cys Ser

                245                 250                 255

Ser Leu Ser Gly Asn Lys Glu Ser Ser Gly Asp Arg Cys Ala Gly Ser

            260                 265                 270

His Ser Ala Thr Ser Ser Gln Gln Glu Val Cys Glu Gly Ile Leu Leu

        275                 280                 285

Met Thr Arg Glu Glu Lys Met Val Pro Glu Asp Gly Ala Gly Val Cys

    290                 295                 300

Gly Pro Val Cys Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Glu Val Arg Asp Ser

305                 310                 315                 320

Arg Thr Phe Thr Leu Val Ser Glu Val Glu Thr Gln Gly Asp Leu Ser

                325                 330                 335

Arg Lys Ile Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Thr Asp Arg Pro Ser Gln Pro

            340                 345                 350

Ser Thr Gly Ser Leu Leu Leu Ile Gln Gln Gly Ser Lys Ser Ile Pro

        355                 360                 365

Pro Phe Gln Glu Pro Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gln

    370                 375                 380

Cys Phe Thr Gly Thr Glu Ser Thr Val Asp Ser Glu Gly Cys Asp Phe

385                 390                 395                 400

Thr Glu Pro Pro Ser Arg Thr Asp Ser Met Pro Val Ser Pro Glu Lys

                405                 410                 415

His Leu Thr Lys Glu Ile Glu Gly Asp Ser Cys Leu Pro Trp Val Val

            420                 425                 430

Ser Ser Asn Ser Thr Asp Gly Tyr Thr Gly Ser Gly Asn Thr Pro Gly

        435                 440                 445

Glu Asp His Glu Pro Phe Pro Gly Ser Leu Lys Cys Gly Pro Leu Pro

    450                 455                 460

Gln Cys Ala Tyr Ser Met Gly Phe Pro Ser Glu Ala Ala Ala Ser Met

465                 470                 475                 480

Ala Glu Ala Gly Val Arg Pro Gln Asp Arg Ala Asp Glu Arg Gly Ala

                485                 490                 495

Ser Gly Ser Gly Ser Ser Pro Ser Asp Gln Pro Pro Ala Ser Gly Asn

            500                 505                 510

Val Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met

        515                 520                 525

Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln

    530                 535                 540

Glu Gly Pro Gly Ser Ala Glu Pro Glu Ser Glu Pro Val Gly Arg Pro

545                 550                 555                 560

Val Gln Glu Glu Thr Leu Ala His Arg Asp Ser Phe Ala Gly Thr Ala

                565                 570                 575

Pro Arg Phe Pro Asp Val Cys Ala Thr Gly Ala Gly Leu Gln Glu Gln

            580                 585                 590

Gly Ala Pro Arg Gln Lys Asp Gly Thr Ser Arg Pro Val Gln Glu Gln

        595                 600                 605

Gly Gly Ala Gln Thr Ser Leu His Thr Gln Gly Ser Gly Gln Cys Ala

    610                 615                 620

Glu

625

<210>2

<211>316

<212>PRT

<213>鼠RANKL蛋白氨基酸序列

<400>2

Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu

1               5                   10                  15

Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro

            20                  25                  30

Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser

        35                  40                  45

Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser

    50                  55                  60

Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu

                85                  90                  95

Asn Ala Asp Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro

            100                 105                 110

Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys

        115                 120                 125

Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala

    130                 135                 140

Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu

145                 150                 155                 160

Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser

                165                 170                 175

Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp

            180                 185                 190

Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn

        195                 200                 205

Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His

    210                 215                 220

Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr

225                 230                 235                 240

Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys

                245                 250                 255

Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr

            260                 265                 270

Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile

        275                 280                 285

Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala

    290                 295                 300

Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp

305                 310                 315