补肾活血汤调控OPG/RANKL/RANK信号通路对激素性肌骨头缺血坏死成骨与破骨的影响

摘要

目的：
　　通过观察补肾活血汤对SD大鼠激素性股骨头缺血坏死OPG/RANKL/RANK信号通路的影响，以探讨补肾活血汤对SD大鼠激素性股骨头缺血坏死OPG/RANKL/RANK信号通路的作用机制，阐释中医补肾壮骨、活血化瘀防治SANFH作用机理，探讨补肾活血汤治疗SANFH的疗效。
　　方法：
　　1.成年 SD大鼠64只，采用随机数字表法分组，分为空白对照组14只，造模组50只，造模组采用脂多糖联合激素造模方法造模。正常组注射相同剂量相同频次的生理盐水。6周后，空白对照组和模型组各随机抽取2只，10％水合氯醛腹腔注射，在麻醉后取出新鲜的SD大鼠股骨头组织行组织形态学检测，验证造模结果。
　　2.造模成功后按人与大鼠体表面积用药量的换算，计算出每只大鼠所需的剂量，补肾活血汤高、中、低剂量治疗组给予含生药浓度分别为2.5g/kg、5g/kg、10g/kg的补肾活血汤灌胃，每天早晚各1次;正常组和模型组在第7～10周，以5g/kg/d的生理盐水灌胃，每天早晚各1次。用含生药浓度为1.0g/ml补肾活血汤制剂计算，低剂量治疗组灌胃剂量为2.5ml/kg，中剂量治疗组灌胃剂量为5ml/kg，高剂量治疗组灌胃剂量为10ml/kg。
　　3.上述五组，经腹腔动脉采血，取血清，检测各组大鼠血清ALP含量;取双侧股骨头光镜下观察股骨头骨组织变化情况;采用蛋白免疫杂交技术，检测SD大鼠股骨头中RANKL、TRAF-6的表达，采用免疫组化检测股骨头OPG表达。
　　结果：
　　1.小剂量脂多糖联合激素造模方法坏死率高，模型可见大片云片状的坏死细胞，潮线不连续甚至撕裂;骨小梁断裂，坏死消失，空骨陷窝率为32.48±2.43，动物死亡率低(3.125％)，造模周期短，造模的用药方法与临床患者更加贴近。
　　2.血清LAP检测:高剂量补肾活血汤能有效提高大鼠体内血清LAP含量，经高剂量的补肾活血汤灌胃的SD大鼠股骨头软骨层可新生类骨质的结缔组织，骨小梁基本连续，坏死明显低于中低剂量治疗组和模型组，具有较好的成骨作用。
　　3.股骨头OPG免疫组化染色表达检测:补肾活血汤灌胃的大鼠股骨头内OPG表达高于模型组，差异具有统计学意义;高剂量补肾活血汤灌胃组OPG免疫组化染色平均吸光度明显及阳性表达率高于中、低剂量治疗组，差异具有统计学意义。表明补肾活血汤具有成骨作用，高剂量的补肾活血汤疗效最佳。
　　4.股骨头RANKL、TRAF-6蛋白免疫印记表检测:补肾活血汤灌胃的大鼠股骨头内RANKL、TRAF-6表达低于模型组，差异具有统计学意义;高剂量补肾活血汤灌胃组RANKL、TRAF-6阳性表达低于中、低剂量治疗组，差异具有统计学意义。表明补肾活血汤具有抑制股骨头破骨因子RANKL、TRAF-6表达作用，高剂量的补肾活血汤疗效最佳。
　　结论：
　　1.小剂量脂多糖联合激素造模方法坏死率高，动物死亡率低，造模周期短，造模的用药方法与临床患者更加贴近，是有效的造模方法。
　　2.高剂量补肾活血汤能有效提高大鼠体内血清LAP含量，高剂量的补肾活血汤灌胃的SD大鼠股骨头坏死明显低于中低剂量治疗组和模型组，具有较好的成骨作用。
　　3.补肾活血汤能增强OPG的表达，具有成骨作用，高剂量的补肾活血汤疗效最佳;补肾活血汤具有抑制股骨头破骨因子RANKL、TRAF-6表达作用，高剂量的补肾活血汤疗效最佳。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 激素性股骨头缺血坏死SD大鼠模型的建立

1 研究目的

2 实验材料

2．1 实验动物

2．2 主要实验试剂及仪器

3 实验方法

3．1 实验动物分组及造模

3．2 SD大鼠股骨头缺血坏死模型的鉴定

4 结果

4．1 动物大体形态观察

4．2 HE染色组织形态学观察

5 讨论

第二部分 补肾活血汤对SD大鼠SANFH形态学观察及生化检测

1 研究目的

2 实验试剂及仪器

2．1 主要实验试剂

2．2 主要实验仪器

3 实验方法

3．1 药物干预

3．2 取材

3．3 血液生化指标的检测

3．4 HE染色组织形态学观察

3．5 统计学处理

4 结果

4．1 各组血清ALP含量比较

4．2 各组骨组织光镜下形态变化情况

5 讨论

第三部分 补肾活血汤调控OPG／RANKL／RANK信号通路OPG、RANKL、TRAF-6相关因子的研究

1 研究目的

2 实验材料

2．1 主要实验试剂

2．2 主要实验仪器

3 实验方法

3．1 蛋白的分离提取、纯化

3．2 蛋白浓度测定

3．3 配胶

3．4 电泳

3．5 转膜

3．6 封闭、免疫杂交

3．7 化学发光、显影和定影及分析

3．8 OPG免疫组化染色及图像分析

3．9 统计学处理

4 结果

4．1 各组股骨头组织RANKL、TRAF-6蛋白表达差异的分析

4．2 OPG免疫组化染色及图像分析结果

5 讨论

结论

参考文献

附录

中英文缩略词表

致谢

文献综述 激素性股骨头缺血坏死基础与临床研究进展

作者简历