基于TRPV1通道探讨缩泉丸对大鼠膀胱过度活动症的作用机制

摘要

膀胱的主要生理功能是储尿与排尿。正常的膀胱感觉功能是实现膀胱储尿和排尿生理过程的基础，且该过程有赖于神经系统、膀胱逼尿肌和尿道括约的协调。膀胱感觉功能主要对下尿路牵张所引起的膨胀、温度、痛觉和伤害性刺激的主观感知。因此，膀胱神经传导、逼尿肌功能等的改变成为膀胱过度活动症的主要诱因，且最新研究发现TRPV1在维持膀胱正常排尿功能的机械感觉中起重要作用，而OAB的发生与膀胱TRPV1的表达异常及其介导的信号传递异常密切相关。缩泉丸在膀胱过度活动症的治疗中取得了广泛而可靠的疗效，但其具体作用机制尚未十分明确，前期研究发现缩泉丸可从肌源性及神经源性改善膀胱功能，本课题将通过观察缩泉丸对TRPV1表达及信号传导的作用，观察其对膀胱感觉功能及运动功能的影响，深入诠释和阐明缩泉丸治疗OAB的药理学作用及机制，为完善缩泉丸改善膀胱功能的作用机制提供科学依据。
　　目的:
　　研究从OAB模型动物及TRPV1基因敲除动物着手，探讨缩泉丸改善膀胱运动功能及感觉功能治疗OAB的作用机制。运用传统的理论与现代的分子生物、电生理学技术相结合的方法，首先通过观察OAB模型大鼠膀胱TRPV1的分布及表达、TRPV1基因敲除小鼠膀胱功能的变化，以验证TRPV1在膀胱功能中的作用;而后通过观察缩泉丸对OAB模型大鼠排尿活动及尿动力学参数的变化、对TRPV1在膀胱表达的变化、对大鼠神经传入电活动的改变;并探讨缩泉丸对TRPV1信号通路的作用。多层次深入揭示缩泉丸基于TRPV1治疗OAB的作用机制。
　　方法:
　　1 OAB模型探索——膀胱出口梗阻大鼠尿动力学动态变化的研究
　　以膀胱出口梗阻法复制OAB模型大鼠，并以假手术组作为对照，分别于2、4、6周后对相应的模型组及假手术组进行尿动力学检测，观察其膀胱压力、容量及储尿期逼尿肌不稳定收缩情况的变化，以确立合适的动物模型用于课题研究。
　　2 TRPV1在膀胱功能中的作用研究
　　2.1 OAB模型大鼠膀胱中TRPV1的表达
　　根据“1”的实验结果所确立的合适的动物模型建立条件，以相同的方法复制得到OAB模型大鼠;获取模型及假手术大鼠的膀胱，以免疫荧光组织化学法通过激光共聚焦显微镜观察TRPV1在各组大鼠膀胱中的分布情况;采用RT-PCR、westernblot检测各组大鼠膀胱TRPV1mRNA及蛋白的表达。
　　2.2 TRPV1-/-小鼠膀胱充盈期盆神经传入电活动的影响
　　从南京模式生物研究所复苏得到TRPV1-/-小鼠，并以野生型小鼠作为对照，通过尿垫实验观察野生型小鼠与TRPV1基因敲除小鼠排尿活动的变化;以多通道生理信号记录仪记录盆神经在灌注过程中的电信号变化，同时尿动力仪进行膀胱内测定，分别进行膀胱内灌注NS、CAP、CPZ，观察灌注过程中盆神经放电信号随膀胱压力、容量的变化。
　　3缩泉丸改善OAB大鼠膀胱功能的作用及机制研究
　　3.1缩泉丸对OAB模型大鼠排尿活动及膀胱功能的影响
　　根据“1”的实验结果确立的模型建立时间，以相同的方法复制得到模型大鼠;灌胃以缩泉丸进行治疗，末次给药后以尿动力仪检测各组大鼠膀胱功能的变化，并进行排尿活动观察。
　　3.2缩泉丸对OAB模型大鼠膀胱TRPV1表达的影响
　　以相同的方法复制得到模型大鼠;缩泉丸干预后获取膀胱，以“2.1”的方法模型大鼠及缩泉丸治疗后膀胱TRPV1的分布情况及其mRNA、蛋白的表达。
　　3.3缩泉丸对OAB大鼠膀胱充盈期盆神经传入电活动的影响
　　以相同的方法复制得到模型大鼠;以缩泉丸进行干预，末次给药后，以“2.2”的方法观察缩泉丸干预后大鼠膀胱灌注过程中盆神经放电信号随膀胱压力、容量的变化。
　　4探讨缩泉丸对TRPV1信号通路的调控
　　4.1缩泉丸对TRPV1-/-小鼠离体逼尿肌功能的影响
　　以TRPV1转基因小鼠为研究对象，获取膀胱逼尿肌肌条，采用powerlab多通道生理记录仪检测缩泉丸对TRPV1-/-离体逼尿肌条α，β-meATP、Carbachol、CAP、KCl诱发的逼尿肌条舒缩反应的影响;收集加入CAP反应后的Krebs试液以荧光素荧光素酶发检测ATP的释放量。
　　4.2缩泉丸对TRPV1-/-小鼠膀胱TRPV1、P2X3 mRNA及蛋白表达的影响
　　以TRPV1转基因小鼠为研究对象，采用RT-PCR、western blot检测TRPV1-/-小鼠及缩泉丸干预后膀胱TRPV1、P2X3 mRNA及蛋白在膀胱中的表达。
　　结果:
　　1确立OAB大鼠模型复制条件
　　尿动力学检测结果显示，2、4周模型组的BLPP、MVP、MBC与相应的假手术对照组比较明显升高;4周模型组RV、NVC与假手术对照组相比明显增多;6周模型组的压力及容量指标亦比假手术组高，其RV显著增多，即使与2、4周组比亦有显著差异，但其NVC有下降趋势，显示模型6周后可能进入失代偿期。因此应选择4周前的模型。
　　2 TRPV1参与了膀胱的运动功能及感觉功能
　　OAB大鼠膀胱TRPV1的分布及其mRNA、蛋白表达显著升高;而当敲除该基因后，小鼠出现排尿反射延长、间隔加长、次数减少的现象，其排尿压力降低，且膀胱充盈期间盆神经放电与野生型小鼠相比明显减弱;野生型小鼠膀胱内灌注TRPV1激动剂CAP可使膀胱压力升高、神经放电增强，而拮抗剂呈相反的效应;而TRPV1-/-小鼠对CAP及CPZ膀胱内灌注无明显反应。
　　3缩泉丸可能通过改善逼尿肌功能及神经感觉功能而治疗OAB，该机制可能与其调节TRPV1在膀胱的表达有关
　　缩泉丸能稳定膀胱逼尿肌，明显减少排尿次数，改善尿动力学参数，改善膀胱功能;其不同剂量均能使OAB模型大鼠膀胱内TRPV1的分布明显减少，使其mRNA及蛋白表达水平明显下降;呈较明显的量效关系。OAB大鼠盆神经放电模式表现为:放电频率先于压力达到峰值，而后压力达到峰值时，放电频率趋于平台或下降。OAB模型大鼠膀胱充盈过程中盆神经放电频率明显增强，缩泉丸的干预能降低盆神经的放电冲动，减少神经放电增强引起的逼尿肌不稳定收缩，并呈剂量依赖性。CAP进行膀胱灌注后，能引起假手术对照组盆神经放电增强，膀胱压力及容量增加，不稳定收缩增多;此效应可被CPZ阻断。CAP内灌注可能因对TRPV1高表达的OAB大鼠膀胱产生去神经化作用，反而能降低其放电增强的情况，减少膀胱压力及容量，并能减少其不稳定收缩;CPZ能显著减少OAB大鼠膀胱TRPV1的分布及表达，使其神经放电减弱，膀胱压力及容量下降;缩泉丸干预后，高、中剂量组可减轻模型动物对CAP灌注所引起的效应，对CPZ灌注无明显变化，提示缩泉丸通过调控TRPV1的表达减轻CAP刺激对膀胱的伤害。
　　4缩泉丸对TRPV1信号通路的调控
　　TRPV1-/-小鼠逼尿肌条ATP释放量明显下降，对CAP刺激无明显反应，对α，β-meATP、KCl、carbachol的所诱发的收缩反应明显下降;TRPV1-/-小鼠膀胱内未见TRPV1 mRNA及蛋白的表达，其P2X3的表达量明显下降;缩泉丸高、低剂量可提高TRPV1-/-小鼠离体肌条ATP释放量，提高其对α，β-me ATP、CAP、KCl及不同浓度的carbachol刺激所诱发的收缩反应，缩泉丸对TRPV1-/-小鼠膀胱内TRPV1、P2X3mRNA及蛋白的表达无明显影响。
　　结论:
　　缩泉丸可明显改善OAB大鼠膀胱的运动功能及感觉功能，该作用与其降低OAB大鼠膀胱内TRPV1的高表达状态有关。其机制可能是通过降低膀胱内TRPV1受体的表达及通过TRPV1信号通路调节神经递质(如ATP)释放及P2X3的表达，从而改善膀胱充盈过程中逼尿肌的不稳定收缩，改善OAB症状。

目录

声明

论文说明

摘要

引言

第一部分 文献研究

第一章 膀胱过度活动症的中西医治疗进展

第一节 OAB的发病机制

第二节 OAB的常用治疗药物

第三节 OAB的中医认识及辨证论治

第四节 缩泉丸及其研究进展

小结

第二章 辣椒素受体(TRPV1)与膀胱功能

第一节 辣椒素受体TRPV1

第二节 TRPV1与膀胱功能

第三节 TRPV1与病理状态下的膀胱功能

第四节 TRPV1作为膀胱功能障碍治疗的药物靶点

小结

第二部分 实验研究

第一章 OAB模型探索--膀胱出口梗阻大鼠尿动力学动态变化的研究

第二章 TRPV1在膀胱功能中的作用研究

第一节 OAB模型大鼠膀胱中TRPV1的表达

第二节 TRPV1-／-小鼠膀胱充盈期盆神经传入电活动的研究

第三章 缩泉丸改善OAB大鼠膀胱功能的作用及机制研究

第一节 缩泉丸对OAB模型大鼠排尿活动及膀胱功能的影响

第二节 缩泉丸对OAB模型大鼠膀胱TRPV1表达的影响

第三节 缩泉丸对OAB大鼠膀胱充盈期盆神经传入电活动的影响

第四章 探讨缩泉丸对TRPV1信号通路的调控

第一节 缩泉丸对TRPV1-／-小鼠离体逼尿肌功能的影响

第二节 缩泉丸对TRPV1-／-小鼠膀胱TRPV1、P2X3 mRNA及蛋白表达的影响

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢