茶枝柑及近缘种的分子鉴别研究

摘要

目的:
　　茶枝柑为芸香科(Rutacae)柑橘属(Citrus)植物，其外层果皮制干，陈化3年以上即为广陈皮，具有理气健脾、和胃止呕、燥湿化痰、疏肝利胆、解结化痈等多种功效。其果肉富含糖类、有机酸、天然维生素等营养物质，同时可作为陈皮茶、添加剂和香料等，具有很高的食用价值。作为广东道地药材的广陈皮，是临床用药的首选药材，开发前景广阔。但由于广陈皮与一般陈皮在市场上价格差异极大，因此市场上多有一般陈皮冒充广陈皮的现象。陈皮与广陈皮的区分主要以产地来分的，广陈皮主产于广东新会、四会等地，陈皮则主产于福建、湖南、江西、重庆、湖北、四川等地。而现有的性状、显微等鉴别方法以及检测陈皮指标性成分等，不适于快速准确鉴别广陈皮与一般陈皮。因此为确保陈皮药材质量稳定可控和临床用药安全有效，建立快速准确鉴别茶枝柑与其他柑橘品种的方法是亟待解决的问题。
　　方法:
　　本研究采用了ISSR分子标记对茶枝柑及近缘种共38份材料进行区分;对比SCoT分子标记和ISSR分子标记的鉴别优势;同时探索SCoT结合克隆测序对物种鉴定的可行性;寻找适合茶枝柑及近缘种鉴别的通用条形码;以及尝试在分子角度上区分茶枝柑的驳枝和芽枝;最后对茶枝柑果皮的DNA提取方法优化，尝试对比不同贮存年限茶枝柑果皮的DNA含量变化，将茶枝柑果皮与叶的基因序列进行对比验证，以期为今后市场上流通的各类陈皮进行准确鉴别。
　　结果:
　　1.采用L16正交设计法对茶枝柑的ISSR反应体系进行优化，最终优化结果为1×PCR buffer,1.5mmol/L Mg2+,0.2mmol/L dNTPs,0.3μ mol/L primer,0.5U Taq酶，50ng模板DNA。通过筛选退火温度及多态性验证后，筛选了11条ISSR引物，共扩增了2126条条带，多态性达到100％，同时通过UPGMA聚类分析将茶枝柑及近缘种38份材料在相似系数0.54～0.94水平上得以区分。
　　2.探讨了SCoT分子标记对比ISSR分子标记的优势以及结合分析效果。以L25正交方法对SCoT反应体系进行优化得到最佳体系为1×PCR buffer，2mmol/L Mg2+，0.25mol/L dNTPs，0.625μ mol/L primer，0.5U Taq酶，20ng模板DNA。最终筛选出了12条引物对38份茶枝柑及近缘种遗传多态性分析，共扩增了2846条条带，多态位点百分率占98.7％。在相似系数为0.54～0.91水平上38份材料得以区分。因此不管是SCoT还是ISSR分子标记均能将38份供试材料分开，虽有一定的差异，但是从总体上来看结果大致相同，说明SCoT和ISSR分子标记是进行茶枝柑及近缘种分子鉴定的有效工具。
　　3.SCOT分子标记结合克隆测序对茶枝柑及近缘种进行了序列比对分析，同源性为63.84％，而遗传距离则在0.001～0.654之间，基于Kimura遗传距离分析材料间的Phylogenetic Tree发现聚为三类，每一种供试材料都存一个或多个突变位点可以作为特异位点与其他供试材料区分开。因此验证了SCoT分子标记技术结合克隆测序在茶枝柑及近缘种的分子鉴别研究是有效的。
　　4.通过4条国际通用条形码对茶枝柑及近缘种的筛选鉴别，其中marK序列测序成功率为50％，rbcL序列变异位点为0，而BLAST比对发现ITS2和psbA-trnH鉴别效率均为100％，因此最终选用了ITS2和psbA-trnH序列作为材料鉴别条形码，通过组合序列分析材料区分度高于单条形码，因此推荐ITS2+psbA-trnH序列作为茶枝柑及近缘种的鉴别序列。
　　5.在分子水平上对茶枝柑驳枝和芽枝区分，通过4条国际条形码筛选，其中ITS2、psbA-trnH和matK序列中均未发现差异位点，而在rbcL序列上芽枝和驳枝得以完全区分，为茶枝柑选苗选育上提供了广泛前景及应用价值。
　　6.建立了cCTAB法作为茶枝柑果皮的有效提取方法，较试剂盒法提高了十倍多产率，而不同贮存年限茶枝柑果皮DNA含量与时间并无明显关联。通过茶枝柑果皮与其叶的psbA-trnH序列比对发现完全一致，进一步验证了DNA条形码的鉴定优势。
　　结论:
　　ISSR分子标记结合SCoT分子标记的遗传多态性高，茶枝柑及近缘种在UPGMA聚类树几乎完全得以区分。SCoT分子标记结合克隆测序得到多个变异位点，可以作为材料的区分位点。ITS2结合psbA-trnH序列适合作为茶枝柑及近缘种的条形码鉴别序列。rbcL序列水平上可将两种繁育方式的茶枝柑完全得以区别。cCTAB法能有效提取10年以上茶枝柑果皮DNA，同时通过psbA-trnH序列比对，验证了条形码的通用性和准确性。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 茶枝柑及近缘种植物研究进展

1．1．1 茶枝柑及近缘种植物的资源分布概况

1．1．2 茶枝柑的分子标记研究现状

1．1．3 茶枝柑的嫁接机理研究现状

1．2 遗传标记研究进展

1．2．1 ISSR分子标记

1．2．2 SCoT分子标记

1．2．3 DNA条形码标记

1．3 小结

第二章 茶枝柑及近缘种的ISSR分子鉴定

2．1 材料与试剂

2．1．1 实验材料

2．1．2 仪器和试剂

2．2 实验方法

2．2．1 样品DNA提取及检测

2．2．2 正交优化ISSR-PCR反应体系

2．2．3 引物筛选

2．2．4 退火温度优化

2．2．5 多态性筛选

2．2．6 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．1 DNA提取结果

2．3．2 PCR反应体系正交优化结果分析

2．3．3 引物筛选及退火温度优化

2．3．4 ISSR-PCR扩增的多态性筛选

2．3．5 ISSR标记的遗传相似性分析

2．3．6 ISSR标记UPMGA聚类分析

2．4 小结与讨论

第三章 ScoT结合ISSR分析茶枝柑及近缘种遗传多态性

3．1 材料与试剂

3．1．1 材料

3．1．2 仪器和试剂

3．2 实验方法

3．2．1 基因组DNA提取与检测

3．2．2 SCoT-PCR反应体系的正交试验设计

3．2．3 SCoT-PCR扩增与检测

3．2．4 SCoT-PCR引物筛选

3．2．5 退火温度筛选

3．2．6 SCoT-PCR多态性引物筛选

3．2．7 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 DNA提取结果

3．3．2 SCoT-PCR反应体系正交优化结果分析

3．3．3 引物筛选及退火温度优化

3．3．4 SCoT扩增的多态性分析

3．3．5 SCoT标记的遗传相似性分析

3．3．6 SCoT标记聚类分析

3．3．7 SCoT和ISSR标记聚类结果比较

3．3．8 SCoT和ISSR标记综合分析

3．4 小结与讨论

第四章 SCoT结合克隆测序对茶枝柑及近缘种鉴定

4．1 材料与试剂

4．1．1 材料

4．1．2 仪器和试剂

4．2 实验方法

4．2．1 基因组DNA提取与检测

4．2．2 SCoT引物筛选与扩增

4．2．3 克隆与测序

4．2．4 序列分析

4．3 结果与分析

4．3．1 DNA提取结果

4．3．2 SCoT扩增结果

4．3．3 凝胶回收浓度

4．3．4 克隆电泳结果分析

4．3．6 基于SCoT19序列的系统进化树分析

4．4 小结与讨论

第五章 茶枝柑及近缘种的条形码鉴别研究

5．1 材料与试剂

5．1．1 实验材料

5．1．2 仪器与试剂

5．2 实验方法

5．2．1 样品DNA的提取

5．2．2 PCR扩增

5．3．2 PCR扩增结果

5．3．3 序列分析及鉴定效率评价

5．3．4 条形码序列种间、种内距离分析及barcoding gap检验

5．3．5 茶枝柑及近缘种的NJ聚类分析

5．4 小结与讨论

第六章 基于条形码对茶枝柑驳枝与芽枝的区分

6．1 仪器与试剂

6．1．1 材料

6．1．2 仪器和试剂

6．2 方法

6．2．1 PCR扩增

6．2．2 电泳检测及测序

6．2．3 序列分析

6．3 结果与分析

6．3．1 DNA提取结果

6．3．2 扩增结果

6．3．3 测序结果

6．4 讨论与小结

第七章 茶枝柑果皮的DNA提取优化及含量对比

7．1 材料与方法

7．1．1 材料

7．1．2 仪器和试剂

7．2 实验方法

7．2．2 DNA提取步骤

7．2．3 DNA产率和质量检测

7．3 结果与分析

7．3．1 不同提取方法优化结果对比

7．3．2 不同贮存年限茶枝柑果皮的DNA质量与含量对比

7．3．3 PCR检测

7．3．4 trnH／psbA-PCR序列验证

7．4 讨论与小结

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢