氯霉素和莱克多巴胺人工抗原合成及鉴定研究

摘要

氯霉素（CAP）是一种广谱高效的抗生素，因其高效价廉，曾作为细菌性疾病的治疗药物广泛应用于人和动物临床及畜牧业生产，但由于其具有严重的毒副作用，长期微量摄入氯霉素将会导致抵抗力下降感染各种疾病。莱克多巴胺（RCT）是一种β2-肾上腺素受体激动剂。最初在临床上主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛。大剂量使用时具有改变动物的营养代谢，降低机体脂肪，提高瘦肉率，同时使动物增重，提高饲料使用率的作用，因而被不法商人用于做饲料添加剂。RCT在动物体内的蓄积性残留会对食用者的安全构成潜在威胁。 本文进行了莱克多巴胺和氯霉素的人工抗原的合成及ELISA检测方法的建立等方面研究，先用莱克多巴胺、氯霉素分别与载体蛋白牛血清蛋白（BSA）合成了免疫抗原，与载体蛋白卵清白蛋白（OVA）合成了包被抗原，再经紫外、红外光谱、凝胶电泳实验证明半抗原与载体蛋白是否偶联成功。研究结果表明：氯霉素人工免疫抗原红外光谱图中3425.7 cm-1处出现O-H伸缩振动吸收峰，1641.2 cm-1和1376.5 cm-1出现了C=O和C-N特征吸收峰，说明生成了酰胺；1000～1200 cm-1出现的宽且强的酚的C-O伸缩振动吸收峰，而BSA的IR中并无此吸收峰，表明合成的人工抗原红外光谱图中具有蛋白质和CAP的特征吸收峰；人工抗原紫外光谱图中保留了氯霉素在226nm处的特征吸收峰，在276nm处也出现了特征吸收峰，说明人工抗原紫外光谱图中呈现CAP和牛血清蛋白的特征吸收峰；电泳图谱鉴定结果表明合成的CAP人工免疫抗原上偶联了30个CAP小分子，合成的CAP人工包被抗原上偶联了37个CAP小分子。 莱克多巴胺人工免疫抗原红外光谱图中呈现了蛋白质类共有的吸收，如3306 cm-1的胺基N-H吸收峰、1653 cm-1的酰胺谱带和1536 cm-1的酰胺谱带。RCT人工抗原在1000～1300 cm-1出现了RCT与BSA偶联后的C-N伸缩振动吸收峰，而BSA的中并无此吸收峰，说明人工抗原红外光谱图中呈现RCT和牛血清蛋白的红外特征吸收峰；人工抗原紫外光谱图中BSA-RCT最大吸收峰特征波长为276 nm，RCT、BSA的特征波长分别为274 nm和278 nm，说明人工抗原紫外光谱图中具有蛋白质和RCT的特征吸收峰；电泳图谱鉴定结果表明合成的RCT人工免疫抗原上偶联了24个RCT小分子，合成的RCT人工包被抗原上偶联了30个RCT小分子。用氯霉素人工抗原免疫母鸡制备抗氯霉素多克隆抗体，根据棋盘滴定抗体效价为64000，抗体的最适工作浓度为1：1500，抗原最佳包被浓度为5μg/mL，确定最佳包被条件为37℃下温育1小时，然后4℃下包被12小时，用间接竞争ELISA法检测一系列浓度的CAP溶液，发现有20％的抑制率，证明氯霉素人工抗原合成成功。通过免疫Balb/C小鼠制备了莱克多巴胺多克隆抗体，抗体效价为192000，抗体最适工作浓度为1：6000，最佳包被浓度为1μg/mL，通过优化实验，确定最佳包被条件为37℃下温育1小时，然后4℃下包被12小时。间接竞争ELISA法测定莱克多巴胺结果表明莱克多巴胺浓度在102～1×105μg/L范围之间曲线呈良好的线性关系，线性回归直线方程为y=0.2538x-0.3331，相关系数r=0.9787。莱克多巴胺的检测范围为126～29141μg/L，抑制率为50％时对应的莱克多巴胺浓度为1905μg/L。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章文献综述

1.1氯霉素概况

1.1.1 CAP化学结构

1.1.2 CAP理化性质

1.1.3 CAP的抗菌范围

1.1.4 CAP作用机理

1.1.5 CAP毒副作用

1.2莱克多巴胺概况

1.2.1 RCT化学结构

1.2.2 RCT理化特性

1.2.3 RCT作用机理

1.3小分子人工抗原合成及鉴定的进展

1.3.1分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联

1.3.2含有胺基或可还原硝基半抗原的偶联

1.3.3含羟基半抗原的偶联

1.3.4人工抗原的鉴定

1.4本研究课题来源及研究意义

1.4.1课题来源

1.4.2本课题的研究意义

1.4.3本课题的主要研究内容

第二章CAP和RCT人工抗原合成及鉴定

2.1前言

2.2试剂与仪器

2.2.1材料与试剂

2.2.2实验仪器

2.3 CAP人工抗原合成

2.3.1 CAP人工抗原合成反应装置图

2.3.2 CAP人工抗原合成反应流程图

2.3.3 CAP半抗原的结构修饰及完全抗原的合成

2.4 RCT人工抗原合成

2.4.1 RCT人工抗原合成反应装置图

2.4.2 RCT人工抗原合成反应流程图

2.4.3 RCT半抗原的结构修饰及完全抗原的合成

2.5人工抗原鉴定方法

2.5.1人工抗原的紫外光谱鉴定

2.5.2人工抗原的红外光谱鉴定

2.5.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定

2.6鉴定结果与讨论

2.6.1紫外鉴定结果

2.6.2红外光谱鉴定结果

2.6.3电泳鉴定结果

2.7本章小结

第三章 CAP和RCT多克隆抗体制备及性质鉴定

3.1前言

3.2试剂与仪器

3.2.1材料与试剂

3.2.2实验仪器

3.3试验方法

3.4 ELISA法鉴定

3.4.1血清效价和最适工作浓度确定研究

3.4.2包被条件优化研究

3.4.3抗原最佳包被浓度确定

3.4.4二抗最佳稀释度确定

3.4.5标准工作曲线建立

3.5结果与讨论

3.5.1 CAP抗体效价和最适工作浓度测定结果

3.5.2 RCT抗体效价和最适工作浓度测定结果

3.6本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢