香蕉黑星病菌黑色素合成关键酶小柱孢酮脱氢酶基因SCD的克隆与敲除载体构建

摘要

香蕉黑星病(Phyllostictamusarum)是一种真菌病害，主要危害香蕉的叶片和果实。为害叶片，导致叶片早衰，影响产量；为害果实，病果则因外观差而导致商品价值降低。近几年该病在我国的大部分香蕉种植区普遍发生，而且发生危害程度越来越严重。黑色素是以附着胞为侵染机构的真菌的重要的毒力因子，附着胞黑色素化不良或不能产生黑色素的突变体，都会失去通过附着胞产生侵染钉而直接从植物表面侵入寄主的能力。形成黑色素化的附着胞从植物体表面直接侵入寄主是香蕉黑星病菌主要的侵染方式。克隆香蕉黑星病菌黑色素生物合成关键酶编码基因之一的小柱孢酮脱氢酶基因SCD，对深入研究该基因的功能奠定基础，进一步可为该病害的防治提供一个有效的作用靶标。 本研究以香蕉黑星病原菌为材料，对其黑色素生物合成途径中的一个关键酶编码基因之一，即小柱孢酮脱氢酶基因SCD进行了克隆和序列分析，并构建了该基因的敲除载体pSH/SCD。结果如下： 1.用一对根据真菌SCD蛋白氨基酸保守序列设计的兼并引物，从香蕉黑星病菌基因组DNA中通过PCR扩增获得417bp的SCD基因片段，根据测序结果，设计特异性引物，用genomewalking技术获得香蕉黑星病菌推测的SCD的全长序列。该推测的SCD基因全长1696bp，序列分析表明，该片段包括完整的开放读码框(738bp)，其中含有一个长29bp的内含子。 2.根据香蕉黑星病菌推测的SCD基因全长序列，用RACE技术和RT-PCR技术，获得香蕉黑星病菌小柱孢酮脱氢酶基因的cDNA序列。SCD基因cDNA全长609bp，编码203个氨基酸，Blast分析其核苷酸或推测的氨基酸序列与其它一些真菌SCD基因之间有较高的同源性。 3.该推测的SCD基因包含一启动子片段(592bp)。在启动子序列中发现几个典型的真核生物顺式调控元件TATA-motif、CAAT-motif、TGAC-motif、ACTGC-motif等4构建了敲除载体pSH75/SCD，用于后续SCD基因的功能验证。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1香蕉黑星病研究概况

1.1.1香蕉概况

1.1.2香蕉黑星病病原学及其防治

1.1.3香蕉黑星病防治

1.2植物病原真菌黑色素与致病性关系的研究进展

1.2.1黑色素的种类及生物合成

1.2.2黑色素合成过程

1.2.3植物病原真菌黑色素与致病性的关系

1.2.4黑色素的其它生理作用

1.3染色体步移技术(Genome Walking)

1.3.1染色体步行PCR

1.3.2染色体步行新技术应用前景

1.4 cDNA末端快速扩增技术(RACE)研究进展

1.4.1 RACE技术原理

1.4.2 RACE的改良和优化

1.4.3 RACE技术的其他应用及其前景

1.5丝状真菌基因敲除研究概况

1.5.1基因敲除的概念

1.5.2丝状真菌基因敲除技术研究现状

1.5.3研究基因的结构与功能

1.6本研究的目的和意义

1.7技术路线

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1供试菌种

2.1.2感受态

2.1.3质粒载体

2.1.4主要培养基

2.1.5试剂和工具酶

2.1.6主要仪器设备

2.2方法

2.2.1菌丝收集

2.2.2香蕉黑星病菌DNA的提取

2.2.3香蕉黑星病病原菌RNA的提取

2.2.4香蕉黑星病黑色素小柱孢酮脱氢酶SCD基因扩增

2.2.5目的片段的回收及纯化

2.2.6 PCR回收产物与T-载体连接

2.2.7香蕉黑星病菌黑色素合成关键酶编码基因SCD的序列测定与分析

2.2.8敲除载体(pSH75/SCD)的构建

3结果与分析

3.1菌丝收集

3.2香蕉黑星病原菌总DNA的提取

3.3香蕉黑星病菌总RNA的提取

3.4香蕉黑星病菌小柱孢酮脱氢酶SCD基因保守区域扩增

3.5 3'RACE扩增

3.5.1.第一轮3'RACE PCR反应

3.5.2第二轮3'RACE PCR反应

3.6基因组步行

3.6.1 3'端侧翼序列的克隆

3.6.2 5'端侧翼未知序列的克隆

3.7全长cDNA扩增

3.8序列分析

3.8.1核苷酸酸序列测定

3.8.2核苷酸序列blastn分析

3.9敲除载体(pSH75/SCD)的构建

3.9.1敲除基因片段扩增以及双酶切

3.9.2载体pSH75双酶切及与SCD基因片段的连接转化

4讨论

4.1 TaKaRa RACE在香蕉黑星病菌黑色素合成关键酶编码基因(小柱孢酮脱氢酶SCD基因)上的应用

4.2染色体步移(Genome Walking)在香蕉黑星病菌黑色素小柱孢酮脱氢酶SCD基因上的应用

4.3香蕉黑星病菌黑色素小柱孢酮脱氢酶SCD基因结构分析

4.4敲除载体构建

5结论

参考文献

致谢