重组人胰岛素在毕赤氏酵母中的分泌表达

摘要

糖尿病是一种全身性慢性疾病，病因复杂，并发症多，治愈率低，成为国际医学的一大难题，被世界卫生组织称为不死的癌症。胰岛素是治疗糖尿病最基础、最有效的药物。目前，国际胰岛素市场几乎全部为基因重组人胰岛素所占据，由于糖尿病属难以治愈的慢性疾病，患者需终生用药，其发病率还随生活方式的改变和社会老龄化而增加，从而构成了人胰岛素市场的基础。胰岛素的需求量也呈直线上升的态势。所以，胰岛素药物有很大的市场空间。 本研究利用套叠PCR合成Insulin基因，并通过克隆、测序验证了Insulin序列，其大小为183bp，并在Insulin序列的A链和B链间引入Kex2蛋白酶切位点。经测序鉴定后，通过XhoI和XbaI以正确的阅读框插入到pGAPZα-A的α-factor信号肽下游，构建成pGAPZa-A/Insulin重组分泌型表达载体。表达载体用BlnI线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化子经Zeocin抗性筛选、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE复筛获得6株分泌型Insulin表达工程菌株，再经高Zeocin抗性梯度筛选、SDS-PAGE鉴定，获得1株高效表达菌株Ig6。以Ig6为发酵菌株进行发酵，分别取24h、48h、72h、96h、120h的发酵上清进行SDS-PAGE，确立了最佳表达时间为96h；重组蛋白的表达水平为32mg/L，占分泌总蛋白的40％左右。Native-PAGE检测结果表明，A链和B链在分泌过程中通过一系列细胞器，得以加工、修饰、折叠，形成与天然结构更为相似，具有高度生物活性的重组Insulin。WesternBlot结果表明，重组蛋白能够与鼠抗人Insulin抗体发生特异性反应，具有与天然Insulin同样的免疫原性。对重组蛋白进行了初步纯化及活性分析，利用MTT法检测工程菌株发酵产物的生物活性，结果表明经表达的重组蛋白具有促进Osteoblast细胞增殖的作用。本研究结果不仅为重组Insulin的研发及临床应用打下了基础，同时也为小分子肽的基因工程药物研发建立了良好的平台，具有重要理论与实践意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1前言

1.1糖尿病现状及其治疗药物

1.2胰岛素

1.2.1胰岛素的结构

1.2.2胰岛素的生物学作用

1.2.3胰岛素的生理生化作用

1.2.4胰岛素分泌的调节

1.2.5胰岛素的研究历程及现状

1.3重组胰岛素在几种常见的蛋白表达系统中的表达

1.3.1大肠杆菌表达系统

1.3.2酿酒酵母S.cerevisiae表达系统

1.3.3毕赤氏酵母P.pastoris表达系统

1.4本研究的目的意义

1.5实验技术路线

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2分子生物学实验常用酶和试剂盒

2.1.3分子生物学常用试剂

2.1.4主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1 Insulin基因片段的合成及连接

2.2.2克隆载体的构建及鉴定

2.2.3酵母表达载体的构建及鉴定

2.2.4工程菌GS115/pGAPZα-A-Insulin的构建与筛选

2.2.5 Zeocin高抗性转化子的筛选

2.2.6重组酵母的摇瓶发酵

2.2.7 SDS-PAGE电泳检测和筛选

2.2.8总蛋白含量的测定

2.2.9发酵产物的Native-PAGE电泳检测

2.2.10 Western blot分析

2.2.11阳离子交换柱层析

2.2.12生物活性检测

3结果与分析

3.1套叠PCR连接Insulin基因片段

3.2克隆载体的构建及鉴定

3.2.1克隆载体构建结果

3.2.2 Insulin测序鉴定

3.3表达载体pGAPZα-A-Insulin的构建

3.4重组质粒线性化结果

3.5酵母的转化和重组酵母的PCR鉴定

3.6 Zeocin高抗性转化子的筛选与鉴定

3.6.1 Zeocin高抗性转化子的筛选

3.6.2 Zcocin高抗性转化子摇瓶表达Insulin

3.7最适发酵时间的确定

3.8发酵上清液中蛋白含量的测定

3.9发酵产物的Native-PAGE电泳检测

3.10 Western blot分析

3.11阳离子交换柱层析

3.12生物活性检测

4讨论

4.1 Insulin的临床应用前景

4.2利用套叠PCR合成基因

4.3选择合适的表达系统

4.4电转化法

4.5关于小分子多肽的SDS-PAGE电泳及其染色方法

4.6 Kex2酶切位点的作用

4.7关于Insulin等小分子肽酵母表达体系的建立

4.8胰岛素与胰岛素抗体的相互作用

4.9本研究今后的主要研究任务

4.9.1进一步提高所筛选菌株的表达量

4.9.2提高表达产物的活性

4.9.3表达产物的动物实验

4.9.4表达产物的测序

4.9.5高表达菌株遗传稳定性实验

5结 论

参考文献

附 录

致 谢