菠萝叶纤维脱胶毕赤酵母工程菌的构建、表达以及应用

摘要

菠萝叶纤维作为新型纺织材料,对它脱胶的研究已经引起人们的关注。果胶裂解酶具有降解果胶的作用,木聚糖酶具有降解半纤维素的主要组成部分木聚糖的作用,因此,果胶裂解酶和木聚糖酶在脱胶的过程中起关键性的作用。本室已在大肠杆菌系统中成功表达了果胶裂解酶PelC,并且保留了表达载体pPIC9K-PelC和果胶裂解酶毕赤酵母工程菌P2。本文在此基础上,从绿色木霉(AS3.3711)中克隆了果胶裂解酶基因xyn2,并将xyn2克隆到酵母穿梭型表达载体pPIC9K,构建了重组表达载体pPIC9K-xyn2。将pPIC9K-xyn2线性化,转化毕赤酵母GS115,并且将pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC同时转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G418高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株X5和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株PX6。
　　 对P2、X5、PX6诱导表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表明:木聚糖酶毕赤酵母工程菌X5分泌表达木聚糖酶,分子量为21KD;果胶裂解酶毕赤酵母工程菌P2分泌表达果胶裂解酶,分子量为43KD;果胶裂解酶和木聚糖酶双价工程菌PX6分泌表达果胶裂解酶和木聚糖酶,分子量分别为43KD和21KD。对P2、X5、PX6诱导表达产物进行酶的活力测定以及性质分析,发现果胶裂解酶毕赤酵母工程菌P2分泌表达果胶裂解酶,活力最高为14.2 U/ml;木聚糖酶毕赤酵母工程菌X5分泌表达木聚糖酶,活力最高为5.8U/ml;果胶裂解酶和木聚糖酶双价工程菌PX6分泌果胶裂解酶活力最高为12.6 U/ml,木聚糖酶活力最高为4.2 U/ml。果胶裂解酶的最适作用温度为50℃,最适pH值为5.4;木聚糖酶的最适作用温度为50℃,最适pH值为6.0。
　　 将双价工程菌PX6发酵生产出高活性的果胶裂解酶和木聚糖酶。用正交的方法确定了菠萝叶纤维脱胶的优化工艺参数为:时间4h,粗酶液用量为12％,pH值为5.5,温度为50℃。脱胶后的结果表明:纤维素的含量得到了提高,特别是对果胶质的降解达到了菠萝叶纤维纺织工艺的要求,但是半纤维素含量偏高。纤维细度得到了提高,同时纤维细度也变小,但是脱胶后断裂强度有所降低。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 课题背景

1.2 菠萝叶纤维资源与利用现状

1.2.1 菠萝叶纤维的总体概况

1.2.2 菠萝叶纤维的性能

1.2.3 菠萝叶纤维的应用前景

1.3 果胶酶的研究进展

1.3.1 果胶酶的定义

1.3.2 果胶酶的类型及作用机理

1.3.3 果胶酶的来源

1.3.4 果胶酶在纺织上的应用

1.4 木聚糖酶的研究进展

1.4.1 木聚糖酶的定义及分类

1.4.2 木聚糖酶的作用机理与酶学性质

1.4.3 木聚糖酶在纺织工业中的应用

1.5 毕赤酵母表达系统研究进展

1.5.1 毕赤酵母表达载体

1.5.2 毕赤酵母表达菌株

1.5.3 外源基因的整合

1.5.4 高拷贝转化菌株的筛选

1.5.5 影响外源基因表达的因素

1.6 本课题研究的主要内容目的和意义

1.6.1 主要内容

1.6.2 目的

1.6.3 意义

2 试验材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 菌种和质粒

2.1.2 生化试剂(盒)

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要培养基和常用溶液

2.2 方法与步骤

2.2.1 木聚糖酶基因xyn2的克隆

2.2.2 pPIC9K-xyrd表达载体的构建与鉴定

2.2.3 含xyn2基因的毕赤酵母工程菌的构建

2.2.4 含pelC基因毕赤酵母工程菌构建

2.2.5 含xyn2基因和pelC基因双价工程菌的构建

2.2.6 三种工程菌的重组表达酶的活力测定

2.2.7 三种工程菌的重组表达酶的性质分析

2.2.8 双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用

3 结果与分析

3.1 xyn2基因的克隆

3.1.1 绿色木霉总ENA提取

3.1.2 xyn2基因片度的分离

3.1.3 xyn2基因序列的测定

3.2 pPIC9K-xyn2表达载体的构建与鉴定

3.3 含xyn2基因的毕赤酵母工程菌的构建

3.3.1 pPIC9K-xyn2重组表达载体的线性化

3.3.2 线性化pPIC9K-xyn2重组表达载体的电击转化

3.3.3 多拷贝插入木聚糖酶基因毕赤酵母工程菌的筛选

3.3.4 多拷贝插入木聚糖酶基因毕赤酵母工程菌的PCR鉴定

3.3.5 表达产物的SDS-PAGE的检测

3.4 含peIC基因毕赤酵母工程菌构建

3.4.1 含pelC基因毕赤酵母工程菌分泌表达产物的SDS-PAGE的检测

3.5 双价工程菌的构建

3.5.1 pPIC9K-xyn2和pPIC9K-pelC重组表达载体的线性化

3.5.2 线性化pPIC9K-xyn2和pPIC9K-pelC重组表达载体的电击转化

3.5.3 多拷贝插入双价工程菌的筛选

3.5.4 多拷贝插入双价工程菌的PCR鉴定

3.5.5 双价工程菌分泌表达产物的SDS-PAGE的检测

3.6 重组表达酶的活力测定

3.7 P2产果胶裂解酶、X5产木聚糖酶、PX6产果胶裂解酶、木聚糖酶性质分析

3.8 双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用

3.8.1 单因子试验分析

3.8.2 多因子试验分析

4 讨论

4.1 绿色木霉RNA的提取

4.2 表达载体的线性化

4.3 电击转化与整合

4.4 表达产物的检测

5 结论

5.1 木聚糖酶基因的获得

5.2 毕赤酵母重组菌的构建

5.3 毕赤酵母重组菌的分泌表达

5.3 毕赤酵母重组菌分泌酶的活力和性质分析

5.4 双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用

参考文献:

附录

附录1.符号宿略表

附录2.pPlC9K表达载体图谱

附录3.菠萝叶纤维脱胶前后对照图

致谢