乌鲁木齐河源区冰缘植物内生细菌多样性及其空间分布特征研究

摘要

本研究首次以生长于高海拔、强辐射、温度波动大的极端环境下的天山冰缘植物为研究对象，利用经典的分离培养方法和分子生物学技术即PCR-RFLP和16SrRNA基因序列分析，对20种冰缘植物的内生细菌的形态和生理特性以及遗传多样性进行了研究，同时还采集了在河源区不同海拔范围均有分布的几种植物，对其内生细菌的群落多样性、遗传多样性和生物学功能及其空间分布规律进行了较为系统的调查和研究，并对冰缘植物、内生细菌及环境之间的关系进行了初步探讨。其主要研究结果如下： 1．从20种冰缘植物中共分离到93株内生细菌，种群密度在0-10<'50>cfu/g FW。其类型和数量与其它环境中的植物内生细菌相当。揭示了极端环境下冰缘植物内生细菌的普遍性和丰富性。 2．对分离物部分特性的测定结果表明，不同冰缘植物中的内生细菌以及同种植物不同分离物之间，其菌落形态和菌体形态以及一些生理特性也呈现出多样性的特征。92.9％的菌株菌体形态为杆状，少数为球状，且各菌株间菌体大小差异较大；61.90％的菌株为革兰氏阳性细菌；还有70.15％的菌株可产生黄色、橘红或粉红色的色素；74.58％属于耐冷菌，-2-37℃生长。说明极端环境下的高山冰缘植物中确实存在着一些能够适应低温，强紫外辐射环境条件的细菌；同时，也反映出了冰缘植物内生细菌对极端环境条件的一些适应机制或生存策略。 3．选用三种限制性内切酶AluI、Hin-6I和RsaI对所有菌株的16S rRNA扩增产物进行RFLP分析，并对谱带差异明显的菌株进行16S rRNA基因扩增和测序。结果表明冰缘植物内生细菌共由α-proteobacteria、γ-proteobacteria、HGC、LGC和CFB五大类群组成，其种属类型非常丰富，有22个属以上的细菌分布。其中HGC类群的种类多样性最丰富，包含12个属的细菌，占总菌群的55.4％；Clavibacter、Agreia和Rhodococcus是此类群的优势菌群。其次为α和γ-protebacteria类群，分别占总分离物的17.9％和19.6％；其中Sphingomonas和Pseudomonas分离频率较高。而CFB和LGC类群的种类和数量相对较为单一和贫乏。 4．16S rRNA基因序列分析表明，冰缘植物中一些菌株如Pseudomonas和Agreia属的成员与其它环境中的一些植物联合细菌具有很高的相似性，而更多的内生细菌(主要是Sphingomonas、Clavibacter和Rhodococcus属的成员)却与冷环境如冰川、冻土以及湖海中的细菌的同源性(99％以上)极高。这一结果进一步揭示出环境条件对内生细菌的种群结构具有很强的选择作用，即相似的环境选择相似的细菌类群。 5．从内生细菌的菌群数量分布来看，同种植物在不同海拔以及不同植物在同一海拔范围内所含内生细菌的群落密度都有较大差异，从低海拔到高海拔均呈现出波动性变化规律，但总体上随着海拔高度的升高而逐渐降低(珠芽蓼和火绒草除外)。 6．从各海拔内生细菌的菌群结构来看，也存在很大差异，并且从低海拔到高海拔呈波动性变化或层状分布的特征。如α-proteobacteria类群是升-降-升-降-升-降的趋势，HGC类群为降-升-降-升-降的变化趋势；而LGC和CFB组则呈现出层状分布规律。从内生细菌属的多样性来看，除在海拔3650m处分离到的菌群相对匮乏外，其它海拔内生细菌的丰富度均较高，在10个属以上。在这些菌群内，有些属在各个海拔范围内都有分布，如Sphingomonas、Pseudomonas、Clavibacter、Rhodococcus等；有些却仅在某一个海拔范围内出现，如Brevundimonas和Agrococcus只在海拔3800m以上出现，而Pantoea只在海拔3550m以下分布。有些几乎在各种植物中都能分离到，如Sphingomonas、Pseudomonas、Clavibacter等，属多宿主兼性内生细菌；而Caulobacter、Methylobacterium、Phyllobacterium则只存在于特定的一种植物中。这可能与宿主植物、菌株自身的特性以及生态环境选择性有关。 7．对冰缘植物内生细菌的空间分布特征分析表明，耐冷菌和有色菌群在各个海拔所占比例都较高，而且随着海拔高度的降低其比例也逐渐降低。这与之前菌群数量随海拔高度的降低而逐渐升高以及各海拔内与植物联合细菌相关的内生细菌随海拔的降低而逐渐升高的变化趋势刚好相反，而与各个海拔范围内与冷环境有关的内生细菌随海拔高度的降低而逐渐降低的分布规律相吻合。冰缘植物内生细菌的这种规律性分布特征揭示了环境条件对微生物类群的分布及其特性具有较强的影响和选择作用，主要是由海拔高度变化引起了温度和辐射强度等的变化，从而导致内生细菌的生存和繁殖受到限制，其生理特性也随之发生变化以适应环境条件的变化。这正是山区气候垂直变化特征的映射和适者生存的良好体现。 8．为阐释外界气候条件对植物内生细菌的影响，对乌鲁木齐河源区不同海拔植物内生细菌菌群数量与气温和降水量的相关性进行了分析。结果表明，菌群数量与气温呈高度正相关关系，而与降水量无相关性。表明气温是影响该区域植物内生细菌的分布和数量的主要因素。 9．对不同环境中细菌类群的比较分析表明，冰缘植物内生细菌的菌群结构和多样性较其它环境微生物更为丰富，总共包含了30个属的细菌。其次为格陵兰冰川和温带植物，分别有20和19个属的细菌分布，天山冻土和慕士塔格冰芯的细菌多样性相对较贫乏。但从菌群组成结构的相似性来看，冰缘植物内生细菌与青藏高原古里雅和慕士塔格冰芯细菌的组成最为相似(72％以上)；天山冻土与格陵兰冰芯细菌次之(65％以上)；与热带和温带植物内生细菌的菌群结构相差较远。并且在冷环境中，HGC类群的多样性最丰富，而在热带或温带植物内生细菌中，γ-proteobacteria类群的细菌占了很大优势。这进一步表明地理位置不同而气候条件相似的环境中所蕴育的微生物的类群也是相似的。 10．内生细菌特性及生物学作用测定结果表明，冰缘植物内生细菌不仅具有自身所处环境造成的耐冷、抗辐射的特性，而且还有溶解难溶性磷(73.33％)和产生IAA(38.89％）功能以及降解有机污染物的潜力。其丰富多样的生物学和生态学作用将是今后深入研究的主题。 11．对部分冰缘植物内生细菌的定殖能力测定结果表明，冰缘植物内生细菌可成功定殖于宿主植物，但部分菌株具有一定的宿主专化性。内生细菌的部分生物学作用和特性以及极端环境中冰缘植物自身的特性则揭示出内生细菌与其宿主之间是一种相互选择、相互适应的多元交互协同作用的关系。 总之，生长在极端环境条件下的冰缘植物与其它生境中的植物一样均含有丰富多样的内生细菌，既有植物内生细菌的一些共性又有宿主自身所处微生态环境所造成的菌群结构和培养特性方面的差异，并且随着微生境条件的变化而呈现出规律性分布的特征。同时还反映和体现了内生细菌、环境条件及其宿主之间的互作关系。其生境特殊性决定了其既有理论研究的广度和深度，又有多方面的应用潜力，是个潜力巨大、尚待开发的微生物新资源。

目录

文摘

英文文摘

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

第一章绪论

第二章材料与方法

第三章结果与分析

第四章讨论与结语

参考文献

在读期间研究成果

致谢