利拉鲁肽在大肠杆菌中的表达、制备工艺研究及活性分析

摘要

利拉鲁肽是一种长效GLP-1类似物,在人体内能模仿GLP-1发挥显著降低血糖、促进胰岛素分泌、修复胰岛β细胞等生理功能。它的半衰期约为11~13h,每天只需注射一次就能很好地控制血糖浓度,并降低患者的体重,是治疗T2DM的理想药物。
　　目的:利用大肠杆菌蛋白融合表达系统、肠激酶裂解蛋白技术、色谱技术分离纯化蛋白及蛋白修饰技术等生物工程技术,实现利拉鲁肽的高效表达及制备,并通过小鼠实验分析利拉鲁肽的降糖活性,为日后国内进一步研发利拉鲁肽的制备工艺提供参考。
　　方法:PCR法扩增获得在Lys26Arg34GLP-1(7-37)基因的N端紧邻牛肠激酶位点、C端带有终止密码子的目的基因LG1,然后连接到 pET31b(+)载体中,构建成表达KSI-Arg34GLP-1(7-37)的重组融合表达载体pET31b(+)-LG1,并转化至(Escherichia coli)BL21(DE3)构建表达工程菌株。利用IPTG诱导发酵菌体表达目的蛋白,发酵菌体经超声破碎、洗涤后得到包涵体蛋白。包涵体蛋白变性、复性处理后,经过强阴离子交换色谱技术初步纯化获得纯度较高的融合蛋白。融合蛋白经过肠激酶进一步裂解,并利用反相色谱技术纯化获得利拉鲁肽前体分子 Arg34GLP-1(7-37)。最后在Arg34GLP-1(7-37)分子的Lys26上连接一条棕榈脂肪酸侧链,得到利拉鲁肽分子,反相色谱技术进一步纯化后制成制剂,并通过小鼠体内活性实验测试它的降糖活性。
　　结果:菌体蛋白以包涵体形式表达,表达量约为2.98g/L,且KSI-Arg34GLP-1(7-37)占总蛋白的35％以上。离子交换色谱纯化重组融合蛋白后,经SDS-PAGE检测它的纯度达85%以上。肠激酶可裂解重组融合蛋白获得大小与理论值相符的Arg34GLP-1(7-37)单体,并通过在它的Lys26上连接脂肪酸侧链后得到的利拉鲁肽分子,其分子量与理论值(3750Da)相符,反相色谱纯化后,经高效液相检测其纯度在98%以上,小鼠体内活性实验表明它具有显著的体内降糖活性。
　　结论:本研究在实验室阶段初步建立了一种制备大肠杆菌利拉鲁肽的方法,为下一步研究利拉鲁肽的生产工艺奠定基础。

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中英文缩略词表

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英文摘要

第一部分 Arg34GLP-1(7-37)菌种的构建及表达

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 利拉鲁肽的制备

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三部分 利拉鲁肽的活性分析

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述

致谢

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